Chromatografie Marco Houtekamer met de studenten: Daphne Suurmond Sanne d’Haens Björn Cousin Patricia de Putter (allen LTO42)

Inleiding/doel de student kan aan het eind van deze les: Principe van chromatografie uitleggen a.h.v. de twee fases Twee detectoren noemen van een GC Twee detectoren noemen van een HPLC Twee overeenkomsten noemen van GC en HPLC Twee verschillen aanduiden tussen GC en HPLC Een aantal berekeningen uitvoeren aan een chromatogram Duur; 60 min Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

inhoud inleiding Chromatografie in het algemeen Principe van chromatografie Begrippen in chromatografie gaschromatografie Achtergrondinformatie Principe: Hoe werkt het? Apparaat: Hoe zit de GC in elkaar? Detectoren van de GC Vloeistofchromatografie (incl. ion-chromatografie) Apparaat: Hoe zit de HPLC in elkaar? Detectoren van de HPLC de verschillen en overeenkomsten tussen de HPLC en de GC Optimalisatie chromatografie Berekeningen Conclusie vragen Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Chromatografie in het algemeen Scheidingsmethode: een mengsel van stoffen scheiden naar de individuele componenten Toepassing: - kleurstoffen in voedingsmiddelen - producten van de olie-industrie Verschillende soorten chromatografie: Open systemen - dunne laag chromatografie - kolom chromatografie Gesloten systemen - gaschromatografie (GC) - vloeistofchromatografie (HPLC, UPLC of IC) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Principe van chromatografie Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Principe van chromatografie Chromatografie bestaat altijd twee fases: - de stationaire fase; meestal een kolom gevuld met actieve deeltjes die een interactie kunnen aangaan met componenten uit het mengsel - de mobiele fase; een gas of een vloeistof die het mengsel door de kolom heen duwt (met soms hoge druk; 200 bar!) De componenten uit het mengsel verdelen zich over beide fases. Afhankelijk van bijv. lading of zuurtegraad blijft een deeltje korter dan wel langer “plakken” aan de stationaire fase. Filmpje. Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Principe van chromatografie Stationaire fase Mobiele fase Scheiden Dit is een voorbeeld van: Open systeem: kolomchromatografie Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Principe van chromatografie Stationaire fase Mobiele fase Scheiden Dit is een voorbeeld van: Gesloten systeem: ionchromatografie Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Basisbegrippen in chromatografie Retentietijd (tR) Dode tijd (t0) Netto retentietijd (t’R) t’R = tR – t0 Capaciteitsfactor (k) (=retentiefactor) k = t’R / t0 Scheidingsfactor (α) (=selectiviteitsfactor) α = t’BR/ t’AR Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Oefeningen Maak de oefeningen van mlochemie. Test Hoofdstuk 18 Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

gaschromatografie Achtergrondinformatie Hoe zit de GC in elkaar? Hoe werkt het? Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

GC: Achtergrondinformatie Wat is het? Scheiding van stoffen in dampfase; selectieve verdeling tussen stationaire en mobiele fase. Toepassingen? Industrie: Bepaling van (on)zuiverheden in een monster Milieu: verontreinigingen in water, grond of lucht Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

GC: hoe werkt het? Film (Thermo) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

GC: hoe zit hij in elkaar Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

E en F: gasfles en gasregelaar (= gas is de mobiele fase!) De meest gebruikte draag gassen zijn: helium, stikstof en tegenwoordig ook waterstof. Gasregelaar regelt de druk van het draagas. (200 bar flesdruk -> 10 bar -> 5 bar werkdruk) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

A. Injecteren. Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

B: de kolom (=stationaire fase!) Kolommen zijn polair, apolair of mix van beiden Belangrijk voor scheiding (Rs !!) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

C: de detector Eigenschappen detector: Grote gevoeligheid Stabiliteit Lineair Korte responstijd Hoge betrouwbaarheid Voorbeelden: FID (verbranding) of MS (massa) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

C: de detector- FID F.I.D.; Flame Ionisation Detector Specifiek; organische verbindingen Massastroomgevoelig Principe: de werking berust op de verandering van de elektrische geleiding van de gasmassa in een waterstofvlam wanneer een organische molecuul in de vlam wordt geleid. Zeer lineair! Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

GC-FID: chromatogram Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

C: de detector- ECD ECD; Electron Capture Detector Specifiek; alleen gehalogeneerde verbindingen Massastroomgevoelig Principe: de werking berust op de eigenschap dat halogeenverbindingen vrije electronen kunnen opnemen. De e- worden geproduceerd door het draaggas te ioniseren met β-straling.(63Ni) Nadeel: beperkte lineariteit en een radioactieve bron! Voordeel: zeer gevoelig (ppb/ppt) The Saga of the Electron-Capture Detector Feb 01, 2007 By Leslie S. Ettre, Peter J. T. Morris LCGC North America Volume 25, Issue 2, pg 164–178 Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

GC-ECD: chromatogram Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

C: de detector- TCD TCD; Thermal Conductivity Detector Niet Specifiek (dus universeel): vrijwel alle verbindingen toepasbaar Concentratiegevoelig Principe: de werking berust op het verschil in warmtegeleiding van gassen.(Brug van Wheatstone) Voornamelijk toegepast bij analyse van H2, O2, N2, CO2, CO, CH4, C2H6 enz. Nadeel: relatief ongevoelig (vanaf 0,1 %) en beperkte lineair Voordeel: makkelijk toepasbaar Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

GC-TCD: chromatogram Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

D. dataverwerking Piek in een chromatogram Je hebt hier een piek, om de oppervlakte van deze piek te berekenen doe je: ½ * Lengte (in mm) * Breedte (in mm) Tegenwoordig wordt de dataverwerking gedaan met speciale software op de PC. Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Oefeningen Maak de meerkeuzevragen op mlochemie (H19 Gaschromatografie) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Vloeistofchromatografie Principe Hoe zit de HPLC in elkaar? Hoe werkt het? Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

HPLC: achtergrondinformatie Wat is het? Uitwisseling van moleculen tussen stationaire fase en de mobiele fase Toepassingen? Milieu: verontreiniging in water, grond of lucht (bijv. PAK’s) Pesticiden/Herbiciden in voedsel Procescontrole: bijv. suikeranalyses Ecologie: voedingsgehaltes in water en grond Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

HPLC: hoe zit hij in elkaar? Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

HPLC: reservoir – mobiele fase! Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

HPLC: pomp Functie: de pomp duwt het eluens (de mobiele fase) door de kolom met een constante flow Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

HPLC: Injector Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

HPLC: kolom (=stationaire fase) Principe: de moleculaire krachten van de verschillende moleculen in een monster worden langer of juist korter vastgehouden (=retentie!) door de stationaire fase. Types: Kationische kolom (Na+, K+, Ca2+) Anionische kolom (F-, Cl-, Br-, SO42-) Normal phase (kolom is polair en eluens apolair) Reversed Phase (kolom is apolair bijv. C18 en eluens is polair) Demo (Thermo) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

HPLC: de detector Eigenschappen detector: Grote gevoeligheid Stabiliteit Lineair Korte responstijd Hoge betrouwbaarheid Voorbeelden: UV(spectro), Refractive index (RI) of conductiviteit (geleidbaarheid) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

HPLC: conductivity detector Geleidingsvermogen detector Principe: meet de verandering in geleiding van de mobiele fase door de aanwezigheid van verschillende ionen in het monster Niet specifiek Vrij ongevoelig (ppm) Micro-elektroden Filmpje Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

IC: chromatogram Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

HPLC: uv/vis detector Principe: componenten absorberen licht bij een specifieke golflengte. MEEST toegepaste detectie (75%!) Zeer lineair Vrij universeel, omdat veel componenten licht absorberen Redelijk gevoelig (LOD =1 ng) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

HPLC-UV: chromatogram Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Oefeningen Maak de meerkeuzevragen op mlochemie (H20 HPLC) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

De HPLC en de GC Verschillen/ Overeenkomsten Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

De verschillen en overeenkomsten tussen HPLC en GC Het zijn allebei chromatografen, dus basisprincipe is gelijk, evenwicht tussen Stationaire fase Mobiele fase Mobiele fase: HPLC; loopvloeistof GC; draaggas Beiden kunnen mengsels scheiden in individuele componenten, daarna kan het gehalte van die componenten worden bepaald. Kolom: HPLC; ionen uitwisseling GC; polair, apolair of mix Allebei de apparaten beschikken over een injector, kolom, detector en dataverwerking.   Injector en Injectievolume; IC; kraan; 10 – 1000 µl GC; poort; 0,1 – 2 µl Resultaten worden weergegeven in een chromatogram Detectoren: HPLC; geleidbaarheid, UV/VIS GC; FID, ECD of TCD Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Optimaliseren van de chromatografische methode Resolutie Temperatuur Lengte van de kolom Stationaire fase Mobiele fase Flow Hoeveelheid geïnjecteerde analyt (stof) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

resolutie Afhankelijk van drie factoren Retentiefactor (k) Scheidingsfactor (α) Schotelgetal (N) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Voorbeelden van resolutie Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Stationaire fase Retentiefactor Grote affiniteit → langere retentietijd en andersom Types: - polair (“water”) - apolair (“olie”) - ionpair (de + en – ionen vormen ionenpaar) - mixen van bovenstaand Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Dimensies van de kolom (Lengte en diameter) Langer → meer inhoud → meer oppervlak van stationaire fase → meer looptijd → retentietijd wordt hoger Diameter deeltjes of kolom kleiner → oppervlak vergroot → meer interactie → piekvorm scherper. Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

temperatuur Verhoging → moleculen trillen harder Affiniteit van component met de stationaire fase wordt minder Retentietijd korter Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Mobiele fase Grote affiniteit → langere retentietijd en andersom. Let op: “apolair likes apolair” en “polair likes polair”. Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Flow Bepaal je met een flowmeter Hogere flow → kortere retentietijd. Stoffen in de mobiele fase verplaatsen zich sneller. Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Hoeveelheid geïnjecteerde analiet/stof beter resultaat →andere hoeveelheid stof injecteren. Meer analiet → verhoogde detecteerbaarheid Minder analiet → verhoogde resolutie Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Berekeningen!!! 100 % methode Verbeterde 100% methode Externe standaard methode (ESTD) Interne standaard methode (ISTD) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Berekeningen: 100 % methode 1 injectie van een monsteroplossing Analyse van een standaard is dus niet nodig Uitkomst is relatief (x % van het totaal) Eis: Alleen toepasbaar als het mengsel zuiver is. Dus: geen piek van oplosmiddel of deze niet integreren. En geen onbekende pieken in het chromatogram. Nadeel: houdt geen rekening met verschil in gevoeligheid (respons) van de componenten Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Berekeningen: 100 % methode De data van de componenten: component RT (min) Piekopp (counts) % O2 6.02 998 16,81 N2 6.64 1002 16,87 CO 8.70 1151 19,38 CH4 12.18 1100 18,52 CO2 14.01 1687 28,41 Totaal - 5938 100 % O2 = 𝑝𝑖𝑒𝑘𝑜𝑝𝑝. 𝑂2 𝑝𝑖𝑒𝑘𝑜𝑝𝑝. 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑎𝑙 ∗100% Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Berekeningen: ESTD methode Minimaal 2 injecties nodig: van een monsteroplossing en een standaard! Vaak is 1 standaard voldoende i.v.m. goede lineariteit van de detector Eis: exact dezelfde hoeveelheid injecteren Eis: chromatografische omstandigheden gelijk Uitkomst is absoluut (bijv. ppm of ppb) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Berekeningen: ESTD methode Responsfactor (f of Rf): een vermenigvuldigingsfactor die de relatie geeft tussen piekoppervlak en (massa)concentratie van een component m (massa) = Rf * A (oppervlak) => Rf = m/A ρ(massaconc) = Rf*A => Rf = ρ/A Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Berekeningen: ESTD methode De data van een monster en een standaard: component Piekopp standaard (counts) monster Conc. Standaard (ppm) Monster A 250 199 105 83,6 B 500 80 160 C 300 5 150 2,50 D 350 110 200 62,9 E 275 145 Bereken eerst de Rf van de component a.h.v. de standaard Rf = ρ/A Bereken daarna de concentratie in het monster ρ= Rf*A Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Berekeningen: ESTD methode De data van een monster en een standaard: component Piekopp standaard (counts) monster Conc. Standaard (ppm) Monster A 250 199 105 83,6 B 500 80 160 C 300 5 150 2,50 D 350 110 200 62,9 E 275 145 conc A in monster = 𝑝𝑖𝑒𝑘𝑜𝑝𝑝. 𝐴 𝑚𝑜𝑛𝑠𝑡𝑒𝑟 𝑝𝑖𝑒𝑘𝑜𝑝𝑝. 𝐴 𝑠𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑎𝑟𝑑 ∗ conc. A in standaard Conc. A in monster = 199 250 ∗ 105 ppm = 83,58 ppm Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Oefeningen: rekenen aan een chromatogram De data van een monster en een standaard: component Piekopp standaard (counts) monster Conc. Standaard (ppm) Monster (%) A 600 444 200 ? B 1200 400 C 800 333 300 Bereken het relatieve gehalte (in %) in het monster via de 100% methode Bereken het gehalte (in ppm) in het monster via de ESTD methode Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Oefeningen: rekenen aan een chromatogram De data van een monster en een standaard: component Piekopp standaard (counts) monster Conc. Standaard (ppm) Monster (%) A 600 444 200 32,24 148 B 1200 400 43,57 C 800 333 300 24,18 125 1377 100 Bereken het relatieve gehalte (in %) in het monster via de 100% methode Bereken het gehalte (in ppm) in het monster via de ESTD methode Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Berekeningen: verbeterde 100 % methode Idem als 100% methode maar nu met Rf factor! 2 injecties: standaard -> voor bepaling Rf componenten daarna monster -> bepaling gehalte Uitkomst is relatief (x % van het totaal) Eis: Alleen toepasbaar als het mengsel zuiver is. Dus: geen piek van oplosmiddel of deze niet integreren. En geen onbekende pieken in het chromatogram. Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Berekeningen: verbeterde 100 % methode De data van de componenten: Comp. RT (min) Area monster (counts) Std Conc. (%) Rf (%/counts) Monster Rf*Area Gehalte O2 6.02 998 1100 20,00 0,0182 18,16 15,68 N2 6.64 1002 900 0,0222 22,24 19,20 CO 8.70 1151 1000 0,0200 23,02 19,87 CH4 12.18 24,42 21,08 CO2 14.01 1687 1200 0,0166 28,00 24,17 Totaal - 5938 5100 100,00 115,84 % O2 = 𝑝𝑖𝑒𝑘𝑜𝑝𝑝. 𝑂2 𝑚𝑜𝑛𝑠𝑡𝑒𝑟 ∗𝑅𝑓 Σ 𝑝𝑖𝑒𝑘𝑜𝑝𝑝 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑜𝑛𝑒𝑛𝑡𝑒𝑛 ∗𝑅𝑓 ∗100% % O2 = 998∗0,0182 115,84 ∗100% Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Berekeningen: ISTD methode Toevoeging van extra component (= de interne standaard) aan monster/standaard Eisen ISTD: moet goed gescheiden zijn (Rs>2) mag niet in monster voorkomen moet ongeveer dezelfde chemische eigenschappen als de te bepalen componenten moet goed mengbaar zijn met standaard en monster Niet altijd eenvoudig om een goede ISTD te vinden! Voorbeeld: analyse % ethanol in monster; ISTD is ook een alkanol (kan zijn 2-propanol) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

Berekeningen: ISTD methode Minimaal 2 injecties nodig: van een monsteroplossing en een standaard! Vaak is 1 standaard voldoende i.v.m. goede lineariteit van de detector Eis van ESTD vervalt! : niet noodzakelijk om exact dezelfde hoeveelheid injecteren Uitkomst is absoluut (bijv. ppm of ppb) Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

conclusie Nu weet je meer over: Chromatografie (basisbegrippen) Gas Chromatografie (GC) Vloeistof Chromatografie (IC) de overeenkomsten/verschillen van GC en LC Berekeningen met chromatografische data Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter

vragen Juni 2016: Marco Houtekamer, Daphne Suurmond, Sanne d'Haens, Björn Cousin & Patricia de Putter