Effect van temperatuursfluctuaties op populatieontwikkeling en co-existentie van cryptische nematodensoorten Titel van mijn bachelorproef: … Stage uitgevoerd in: … Wouter T’Jonck Stagementor: Nele De Meester i.o.v. Dr. Sofie Derycke Stagebegeleider: Dr. Stefanie Salliau

Overzicht Biodiversiteit en cryptische soorten Litoditis marina (vroeger: Pellioditis marina) Quantitative real time polymerase chain reaction Doelstelling Experimenteel: - Opzet experiment - Workflow Optimalisatie van een qPCR protocol Effect van temperatuursfluctuaties Conclusie

Biodiversiteit en cryptische soorten Biodiversiteit bij bodemdieren Biodiversiteit ~ mariene ecosystemen Nematoden Cryptische soorten Onder hetzelfde species geclassificeerd Onderschatting van de biodiversiteit Nieuwe technieken ontwikkelen om biodiversiteit beter in kaart te brengen (vb. qPCR) Cryptische soorten= soorten onder hetzelfde species geclassificeerd omdat ze morfologisch sterk op elkaar gelijken, maar ze zijn wel GENETISCH verschillend Probleem voor experimenten: geen één specifiek kenmerk waarmee ze van elkaar kunnen onderscheiden worden Nieuwe technieken: werkt met genetisch materiaal  biodiv. Beter in kaart brengen Onderzoek naar belang van biodiversiteit bij bodemdieren voor het functioneren van het mariene ecosysteem. Bijzondere aandacht voor nematoden (zeer diverse groep, hoge abundanties) Populatiegenetisch onderzoek  ontdekking van cryptische soorten  Onderschatting biodiversiteit Nieuwe technieken: werken met genetisch materiaal en niet morfologie Verschillen genetisch van elkaar

Litoditis marina Mariene nematode Kosmopolitisch Speciescomplex 10 cryptische soorten (PmI – PmX) Genetische divergentie (COI, D2D3, ITS) PmI, II, III en IV Morfologische divergentie Cytochroom oxidase subunit I Pop. Gen studie (vergelijken van sequentie van DNA barcodes)  10 cryptische soorten  met 4 cryptische soorten morf. Onderzoek (# morf kenmerken vergelijken)  morf. div Vrijlevende mariene nematode Speciescomplex: minstens 10 cryptisch soorten (niet onderscheiden door één specifiek kenmerk) - kosmopolitisch = veel plaatsen (Antarctica, Zuid-afrika, België, Nederland) - Morfologische divergentie: vergelijken van verschillende morfologische kenmerken Genetische divergentie: internal transcribed spacer region  qPCR met speciesspecifieke primers COI: cytochroom oxidase I Genetische div.  morf. Div.

Quantitative real-time polymerase chain reaction Gebaseerd op klassieke PCR SYBR® Green Absolute kwantificatie Gebaseerd op klassieke PCR Sybr green in PCR mix (bindt op dsDNA) Na elke cyclus (voor denaturatie volgende cyclus) wordt fluorescentie gemeten Amplificatiecurve  cyclus tegenover fluorescentie Belangrijke deel= Cq waarde (=…)  verband tussen Cq en hoeveelheid startmat  meer startmat, lagere Cq Standaardcurve (Cq tov startmat) in dit geval log aantal nematoden

Doelstelling Optimalisatie van een qPCR protocol voor de absolute kwantificatie van cryptische nematodensoorten Effect van temperatuursfluctuaties op populatieontwikkeling en co-existentie van cryptische nematodensoorten Optimalisatie  protocol toepassen om nematoden te kwantificeren om zo het effect van abiotische factoren op populatieontwikkeling en co-existentie na te gaan  hier wordt invloed van temperatuursfluctuaties nagegaan … Protocol voor Absolute kwantificatie Cryptische soorten (PmI-IV) Aantal experimenten doen waarbij combinaties van de cryptische soorten onder diverse omgevingsomstandigheden bekeken worden En nagaan welke soorten onder welke omstandigheden het beter doen Hoe kwantificeren: qPCR

Opzet experiment Twee temperatuursomstandigheden Constante temperatuur (20°C) Fluctuerende temperatuur (15°C - 25°C) Duur experiment: 21 dagen Samenstelling Monospecifiek (1 soort) Combinatie van soorten PmII uitgestorven tijdens experiment (ook stockculturen); te veel inteelt Fluctuaties om te 12 uur Duur: 21 dagen, elke 7 dagen platen invriezen Monospecifiek (elke soort apart)

Workflow Nematoden uit agar halen Dataverwerking qPCR analyse DNA van de stalen verdunnen tot 10 ng/µl Verdunningsreeks maken van de standaarden DNA extractie volgens het CTAB protocol Aanmaken van standaarden en/of stalen Scheiden en tellen van juvenielen en adulten Nematoden uit agar halen Wrm adulten en juvenielen scheiden  verschillende aantal cellen  verschillend aantal kopiën ITS  betere kwantificatie Voor monospecifieke experimenten: tellingen Voor qPCR analyse (optimalisatie + combinatie soorten) - Nematoden uit agar: agar ontdooien  water 70°C - Scheiden: zeven (32µm, 125µm) - Tellen: binoculair Aanmaken standaarden en stalen: pipetteren DNA extractie DNA verdunnen om inhibitie te voorkomen (verdunningsfactor noteren)  linken aan stcurve volgende figuur Dataverwerking: Lightcycler software + statistische verwerking

Resultaten optimalisatie Extractieprotocol is efficiënt Beste standaarden Onderschatting en overschatting bij kwantificatie Efficiëntie extractieprotocol getest met verse culturen  10-voudige verdunningsreeks  qPCR  beste aantal bepalen (beste curve) Beste standaarden: evenveel mix nema voor vers en ingevroren (behalve PmI). Ook voor adulten. 100 juv voor elke soort. Kwantificatie van zelfgemaakte experimentjes (gekend aantal nematoden) Onderschatting (PmI, II, IV) en overschatting (PmIII)

Discussie optimalisatie qPCR protocol staat nog niet op punt Onderschattingen Afbraak DNA Agar Overschattingen (PmIII) Lage DNA concentratie standaarden Mogelijke oplossingen: Nematoden na tellen zo snel mogelijk invriezen Agarpellets verkleinen Relatief kwantificeren i.p.v. absoluut Onderschattingen: *Grootte agarpellet bepaald grootte supernatans na eiwitprecipitatie  750µl supernatans (=DNA) + 750µl iso  deel DNA blijft achter *afbraak DNA: hele dag op ijs Overschattingen: PmIII DNA extractie meerdere keren zeer lage concentratie standaarden Oplossingen: - Snel mogelijk invriezen  minder kans op DNA afbraak Agarpellets verkleinen (hogere T water bij extractie OF hogere RPM bij centrifugeren) Relatief kwantificeren (niet totale concentratie is belangrijk, maar wel verhouding tussen hoeveelheid DNA van verschillende soorten)

Resultaten experiment Monospecifieke experimenten Fluctuerende temperatuur: - PmI < PmIII - PmIV < PmIII PmIII constante T < PmIII fluctuerende T Adulten: geen verschil tussen temperatuursomstandigheden PmII uitgestorven  geen resultaten Enkel tellen, geen qPCR Grote foutenvlaggen: 1 of enkele vrouwtjes in begin onvruchtbaar  Populatie groeit minder snel Significante verschillen komen door het aantal juvenielen Adulten niet beïnvloed door temperatuur  geen significant verschil tussen cte en fluct T

Resultaten experiment Combinatie: PmI + PmIV Constante T: PmI overheerst Fluctuerende T: betere co-existentie Verhouding tussen beide soorten over drie tijdstippen qPCR protocol niet op punt  resultaten niet echt betrouwbaar Experiment liep slechts 21 dagen  mogelijk dat na 21 dagen PmIV volledig verdrukt wordt

Discussie experiment Monospecifieke experimenten Combinatie PmI + PmIV PmIII kan best omgaan met temperatuursfluctuaties Aantal adulten wordt niet beïnvloed door temperatuur Combinatie PmI + PmIV PmIV meer competitief bij fluctuerende T Onverwacht resultaat: PmI en IV zijn in de natuur nog niet samen aangetroffen Onverwacht resultaat: waarom onverwacht (PmI +IV kunnen co-existeren, hoewel ze totnogtoe in de natuur niet samen worden aangetroffen) -Niet linken aan populatieontwikkelingen *monospecifieke experimenten Verklaring PmIII: nieuwe conditie = stress  PmIII kan beter omgaan met deze stress en is een betere groeiomstandigheid voor PmIII? PmIII meest competitief bij combinatie soorten (fluct T)?? wrm adulten niet beïnvloed: juvenielen  dauer larve door overbevolking  juvenielen groeien niet uit tot adulten Combinatie - PmIV meer competitief, mss omdat PmIV zich mss beter aan temperatuursomstandigheid kan aanpassen (stress) onverwacht: PmI en IV komen in natuur zelden samen voor, blijkbaar is temperatuur één van de abiotsiche factoren die de co-existentie beïnvloeden. In natuur zijn er weliswaar nog veel andere abiotische en biotische invloeden

Conclusie Optimalisatie van het qPCR protocol Verdere optimalisatie is nodig Relatief kwantificeren Effect van temperatuursfluctuaties PmIII ontwikkelt zich beter bij fluctuerende temperatuur Aantal adulten wordt niet beïnvloed door temperatuur Co-existentie: onverwacht resultaat Standaarden OK Verdere optimalisatie: invloed agar wegwerken Onverwacht resultaat Benadrukken dat resultaten niet 100% te vertrouwen zijn, omdat het protocol nog niet op punt staat

Effect van temperatuursfluctuaties op populatieontwikkeling en co-existentie van cryptische nematodensoorten Titel van mijn bachelorproef: … Stage uitgevoerd in: … Wouter T’Jonck Stagementor: Nele De Meester i.o.v. Dr. Sofie Derycke Stagebegeleider: Dr. Stefanie Salliau

Standaardcurve 10 en 30 PmI nematoden (uit verse culturen)

Effect van de agar

Kwantificatie PmI en II

Verhouding PmI en IV op drie tijdstippen

Nanodrop 2000

Smeltcurve