Metagenomica of de technologische evolutie voor de identificatie van micro-organismen Prof. Georges Daube Dr Bernard Taminiau Dr Laurent Delhalle Université de Liège Faculté de Médecine vétérinaire, FARAH Département des Sciences des Denrées alimentaires Microbiologie Georges Daube est fondateur, actionnaire et conseiller scientifique de la société Quality Partner s.a., société spin-off spécialisée en contrôle-qualité à destination de l’agro-alimentaire et réalise de nombreuses recherches avec des sociétés agro-alimentaires

Doel van de presentatie Waarom de microflora in vlees bepalen? Vandaag en morgen, hoe bepalen? De microbiologische populatie van o Filet americain préparé o Hesp Conclusie 2

Waarom de microflora in voeding bepalen? Het beter beheren van de microbiële flora maakt het mogelijk om de voedselverspilling en de risico’s op besmettelijke ziektes te verminderen. Deze eigenschappen zijn afhankelijk van een ingewikkelde wisselwerking tussen de aanwezige micro-organismen en zijn de reden waarom het gehele ecosyteem gekend en beheerst moet worden. 3

Waarom de microflora in vlees karakteriseren? 4 Bederf 10 8 kve/cm kve/g Initële contaminatie -Normaal 10 3 kve/cm 2 -Verhoogd 10 6 kve/cm 2 -Normaal: kve/g -Verhoogd:10 1 kve/g X 10 5 (17 gén.) X 10 2 (7 gén.) X 10 9 (30 gén.) X 10 6 (20 gén.) Aërobe kiemen (Pseudomonas) > 0°C Anaërobe kiemen (Clostridium) > 10°C Oppervlakte In de diepte

Detectiemethode, tellingen en identificatie van micro-organismen 5

6 6 Detectie 24 u 3-7 d Tellingen 24 u tot 5 d. De cultuurmethodes zijn langzaam en men kan slechts 1 microbiologische populatie detecteren of tellen per keer. Julius Pétri, Robert Koch, Louis Pasteur, Ze ontdekken, ze tellen

7 Metagenomica (gericht) Meer dan identificaties/m. 200 monsters per keer Hoogdebiet sequenties, zonder cultuur, maakt het mogelijk om na enkele dagen de samenstelling van een microbieel ecosysteem te kennen. Profiel van microbiële diversiteit Meer dan identificaties/m. 20 monsters per keer 1 analyse

8 Bepalen van de concentratie van elk type bacterie aanwezig in het voedingsmiddel Verhoudingen(%) Metagenomica Tellingen (kve/g) Drempel voor potentiële veranderingen

9 « Filet américain préparé » Microbiële populatie Voorverpakt in supermarkt (SM1 ) Slagerij in Supermarkt (SM2 ) Zelfstandige slagerij (butchery) Restaurant Broodjesbar (sandwich) D 0 D 2 (D 1 4°C + D 2 8°C) D aankoop Metagenomica studie (16S rDNA V1-V3) van 58 monsters steaks tartares aangekocht in België.

10 « Filet américain préparé » Microbiële populatie (Bray-Curtis index) G2 Streptococcus thermophilus Xanthomonas G1 G3 Clostridium haemolyticum G6 Lactobacillus algidus Lactococcus piscium G7 Geen dominante flora G8 Leuconostoc gelidum G4 Lactobacillus algidus J2J2 J2J2 G5 Photobacterium Lactobacillus algidus Lactococcus piscium J0J0 J0J0 G9 Pseudomonas Brochothrix J0J0 J0J0

11 « Filet américain préparé » Microbiële populatie De karakterisering van de microflora van deze vleesproducten via de metagenomica maakt een differentiatie mogelijk in functie van: o de kwaliteit van het vlees (grondstofbesmetting, conserveringsvoorwaarden, versheid) gebruikt voor de bereiding, o de gebruikte ingrediënten (groenten, kaas, kruiden), o de gebruikte bewaarmiddelen in de saus en het type verpakking om de productstabiliteit te verzekeren: de ganse aanwezige microflora, een groot gedeelte van de microflora zonder de Lactocillus algidus, in mindere mate de bederfflora (Leuconostoc, Brochothrix). Sommige industriële voorverpakte producten onderscheiden zich van de bereide producten en zijn dikwijls stabieler.

Context 12 Ham Studie Microbiële populatie o Zuid-Europese leverancier, ter plaatse geslacht, warme versnijding, en skin verpakt, vervoer naar Belgie o Transport 3-4 dagen o Problematiek: transport is niet optimaal (soms > 10°C, niet constant) o T.K. bij THT producent> Toegestane limiet opgelegd door de leverancier gebaseerd op de tabel van Univ. Gent (actuelle toegestaane Ref.) o Voor leverancier:  Zware specifieke investering  Volledig afhankelijk van producent die goederen vacuüm levert  Moeilijk om de producent goed te adviseren  Definitieve verantwoordelijke voor THT, bij leverancier die etiketteert

13 Microbiële populatie Ham Studie Analyses en resultaten Basiswerk: Product organoleptisch conform - 3 loten geanalyseerd d 0 en d THT - 2 loten bij d 0 ontvangst Belgie - 1 lot bij d 0 van zuid Europa Aanwezigheid in al de loten Carnobacterium sp overwegend d THT  Indicator bij luchtdichtverpakken (anaerobiose) en de T > 4°C De monsters d 0 zuid europa bevatten grotendeels Carnobacterium sp Is niet zo voor de monsters D 0 België  Koude keten Verhoogde microbiële tellingen Bacteriële populatie bevat weinig bederfflora D0 DTHT Monster 1 D0 DTHT Monster 2 D0 DTHT Monster 3

14 Microbiële populatie Ham Studie Conclusie Met dank aan Veel van de aanvankelijk geweigerde loten op basis van de huidige microbiologische methoden kunnen nu worden aanvaard als de kwaliteit en de veiligheid worden gegarandeerd. Het advies van SciCom (Avis ) beveelt aan, dat bedrijven de mogelijkheid hebben om aan het FAVV te bewijzen dat de overschrijding niet wordt veroorzaakt door een laag hygiëneniveau. Algemeen: Een duidelijke illustratie van de invloed van de koudeketen op de groei van bepaalde flora. In geval van overschrijding van het T.K., moeten de huidige microbiologische methoden worden aangevuld met een identificatie- analyse van de aanwezige microbiologische flora om de Iberico monsters al dan niet conform te valideren.

De nieuwe aanpak voor het beheren van de microbiologische flora in voeding Een nieuw tijdperk voor het beheren van de micro- organismen in onze voeding is aangebroken dankzij deze nieuwe analysetechniek: o Selecteren en/of bevorderen van de goede competitieve beschermflora voor alle categorieën van bederfgevoelige voeding o Snelle oplossing van problemen met technologieën en contaminaties o Ontwikkeling van een nieuwe methode voor de kwaliteitscontroles gebaseerd op de opvolging van het gehele ecosysteem o Snelle en betrouwbare realisatie van epidemiologische studies 15

Conclusie Momenteel maken we de grootste revolutie in deze eeuw mee (sinds de uitvinding van de Petriplaten) wat betreft de kennis van microbiële ecosystemen door middel van high-speed sequencers De beperking is niet op het niveau van de capaciteit van de analyses in het laboratorium maar is gebaseerd op o de capaciteit v.d. bio-informatische analyse de massa van de beschikbare gegevens o De beschikbaarheid aan relevante datagegevens voor het interpreteren van de bekomen gegevens in verschillende contexten, omgevingen o De interpretatie van de resultaten door multidisciplinaire teams o De verbeelding en creativiteit 16

17 Onze twee teams voor de Moleculaire Genetica (ULg LMDA en Quality Partner s.a.)