De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

Optimalisatie van HRMCA toepassingen Genotypering BRCA1/2 SNP’s Mutatiescanning NF1 Mutatiescanning NF1 Filip Slabbinck.

Verwante presentaties


Presentatie over: "Optimalisatie van HRMCA toepassingen Genotypering BRCA1/2 SNP’s Mutatiescanning NF1 Mutatiescanning NF1 Filip Slabbinck."— Transcript van de presentatie:

1 Optimalisatie van HRMCA toepassingen Genotypering BRCA1/2 SNP’s Mutatiescanning NF1 Mutatiescanning NF1 Filip Slabbinck

2 Overzicht Inleiding Borstkanker Neurofibromatose type 1 Technieken: HRMCA – Mutatiedetectie – Genotypering met behulp van ongelabelde probes Resultaten Conclusie

3 Inleiding en doelstelling BRCA1/2 gescreend dmv High Resolution Melting Curve Analysis (HRMCA) NF1 gescreend dmv directe sequenering op cDNA  omslachtig en arbeidsintensief Algemene doelstelling: optimaliseren van 2 HRMCA toepassingen – Genotypering mbv ongelabelde probes van BRCA1/2 SNP’s – Mutatiescanning van het NF1 gen

4 Borstkanker Incidentie – 2 e grootste doodsoorzaak – meest voorkomende kanker bij vrouwen – Risico-ontwikkeling: ± 1 op 10 – 1% borstkankerpatiënten zijn mannen

5 Borstkanker Genetische gevoeligheid – 80% sporadische kanker – 5-10% genetische oorzaak – Onderscheid erfelijke en familiale borstkanker Erfelijk – 5-8% alle borstkankers – Autosomaal dominant – 80% families een BRCA-mutatie – Verhoogd risico op ovariumkanker Familiaal – 15% alle borstkankers – 15-30% families een BRCA-mutatie – verhoogd risico op ovariumkanker

6 Borstkanker BRCA1/2 – BRCA1 Positie: 17q21 24 exonen – BRCA2 Positie: 13q exonen – Tumorsuppressorgenen Verantwoordelijk voor 70-80% van alle erfelijke borstkankers Personen met mutatie  verhoogd risico

7 Neurofibromatose type 1 (NF1) Klinische aspecten en diagnostische criteria – Neurofibromatose type 1 of ziekte van Von Recklinghausen – Autosomaal dominant – NF1 tumorsuppressorgen – Variabele expressie

8 Neurofibromatose type 1 (NF1) NF1 gen – Positie: 17q11.2 – 60 exonen – Mutatie analyse  moeilijk

9 Technieken: HRMCA LCGreen Plus – dsDNA-verzadigende fluorescente kleurstof

10 Technieken: HRMCA Mutatiedetectie met HRMCA – Principe: thermostabiliteit – T : dsDNA denatureert  ssDNA – Smeltcurve: fluorescentie uitgezet tov temperatuur 100% fluorescentie 0% fluorescentie

11 Technieken: HRMCA Genotypering mbv ongelabelde probes Eenvoudig en snel Asymmetrische PCR Probelengte : bp

12 Resultaten Genotypering mbv ongelabelde probes – 4 genotyperingsprotocols geoptimaliseerd – Belangrijke parameters: Ta, DMSO en aantal cycli SNP c C>T BRCA1 8: Ta 53°C, 50 cycli en 3% DMSO SNP c.2201 C>T BRCA en 11.9 – Ta 58°C, 50 cycli: links BRCA1 11.8, rechts BRCA CCTT CT CC CT TT CC TT CT

13 SNP c.7470 G>A BRCA – Ta 53°C, 55 cycli 1 probe  verschillende SNP’s (vb. SNP c.2201 C>T en SNP c.2196 G>A) GGAA GA Legende: GA (heterozygoot) GG (homozygoot wild type) CC (homozygoot wild type) CT (heterozygoot) TT (homozygoot variant)

14 Validatie dmv een blinde screening – 95 patiënten – 3 SNP’s met 100% accuratie detectie CC TT CT

15 Resultaten Mutatiescanning van het NF1 gen – 11 van de 60 exonen geoptimaliseerd met PCR55 – Exon 2 geoptimaliseerd na sequeneren Na sequeneren  rode curven = SNP (c.168 C>T (p.Ser56Ser)) – Belangrijke parameter: lengte – Validatie van ieder exon gebeurt met positieve en negatieve controles

16 Conclusie HRMCA – Eenvoudig – Snel – Goedkoop – gevoelig Genotypering mbv ongelabelde probes – Doorgedreven optimalisatie is vereist Mutatiescanning van het NF1 gen – Toekomst: na validatie  overschakeling naar HRMCA Algemeen – Optimalisatie HRMCA protocols  sterke reductie sequeneren

17 Dank aan Kathleen Claes Mieke Demeyere Kim De Leeneer Ilse Coene Justine Simkens


Download ppt "Optimalisatie van HRMCA toepassingen Genotypering BRCA1/2 SNP’s Mutatiescanning NF1 Mutatiescanning NF1 Filip Slabbinck."

Verwante presentaties


Ads door Google