Dopingcontroles anno 2008, de laboratoriumanalyse

Presentatie over: "Dopingcontroles anno 2008, de laboratoriumanalyse"— Transcript van de presentatie:

1 Dopingcontroles anno 2008, de laboratoriumanalyse
DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

2 Dopingcontrolelaboratoria
Sinds jaren 60 ontstaan Sinds 1981 IOC accreditatie -PT Sinds 2002 WADA accreditatie ISO17025 ISL en TD: Analytisch/Juridisch/Administratief PT testen (aangekondigd en blind) 2008: 33 WADA laboratoria wereldwijd DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

3 Dopingcontrolelaboratoria
DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

4 DoCoLab – historische evolutie aantal stalen
DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

5 DoCoLab – historische evolutie aantal stalen
DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

6 DoCoLab – historische evolutie % positieve
DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

7 Traditioneel in top 3 % positieve
DoCoLab Enige in Benelux Ca. 10de grootste internationaal (aantal routinestalen) wereldwijd 2006: – 1,96% pos Traditioneel in top 3 % positieve 2de grootste aantal wet. publicaties/jaar : 24 A1 – 6 onderzoekers DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

8 Scope en toepassingsgebied
Verboden middelen en methodes: OOC Anaboliserende substanties Hormonen en gerelateerde b-agonisten Hormoon antagonisten en modulators Diuretica en andere maskeermiddelen M1: Verbetering van het zuurstoftransport M2: Chemische en fysische manipulatie M3: Genetische doping DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

9 Scope en toepassingsgebied
Verboden middelen en methodes: IC Alles OOC Stimulantia Narcotica Cannabinoiden Glucocorticosteroiden Verboden middelen in specifieke sporten: IC Alcohol Beta-blokkers DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

10 Matrix Urine Bloed Serum Alle “klassieke” middelen
A-staal 50 ml; B-staal 25 ml Bloed Homologe bloedtransfusie Serum groeihormoon DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

11 TLC RIA GC – FID/ECD/NPD
Technieken: ‘70 TLC RIA GC – FID/ECD/NPD DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

12 GC – FID/ECD/NPD HPLC-UV GC-MS ELISA
Technieken: ‘80 GC – FID/ECD/NPD HPLC-UV GC-MS ELISA DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

13 GC –NPD HPLC-UV GC-MSn ELISA Immunologische testen (hCG) LC-MSn
Technieken: ‘90 GC –NPD HPLC-UV GC-MSn ELISA Immunologische testen (hCG) LC-MSn DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

14 Immunologische testen (hCG, hGH) LC-MSn
Technieken: Nu - GC-MSn Immunologische testen (hCG, hGH) LC-MSn Gelelectroforese/immunoblotting/ chemiluminescentie GC/C/IRMS Flowcytometrie DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

15 Kwaliteitszorg ISO17025 WADA ISL, TD’s
1e lijnscontroles: per batch min. 2 negatieve en 1 positieve controle ISTD’s in alle stalen 2e lijnscontroles: alle methodes/analysten: min. 1 blinde QC/jaar 3e lijnscontroles: WADA PT, WAADS PT, CSCQ, dubbel blinde QC A-staal: screening en confirmatie: onafhankelijke controle B-staal: extra garanties voor atleet DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

16 Het verhaal van een staal…in het lab
Staalontvangst Verificatie verzegeling en conformiteit Verificatie begeleidende documentatie (anonimiteit!) Registratie en verificatie : e-lab in-house LIMS Chain-of-custody start A-staal: analyse – B-staal: diepvries/koelkast DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

17 Het verhaal van een staal…in het lab
Screening pH en SG GC/MS: 2 analyses Narcotica, stimulantia, beta-agonisten, anabolica, aromatase-inhibitoren, THC LC/MS: 2 analyses Anabole steroiden, aromatase-inhibitoren, beta-agonisten, corticosteroiden, diuretica en beta-blokkers hCG (♂) EPO HES DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

18 Het verhaal van een staal…in het lab
GC/MS en LC/MS: staalvoorbereiding aliquotering (bl, sbl, QC) pH-aanpassing enzymatische hydrolyse (narcotica, anabolica, aromatase-inhibitoren) LLE - SPE OFN Derivatisatie (GC-MS) DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

19 Het verhaal van een staal…in het lab
GC/MS Analyse : 4 Agilent MSD ANAL-15: GC-MS (SIM); uitprint: 10 p Steroidprofiel: T, E, DHEA, DHT, Adion, Andro, Etio,… Ca 45 anabole steroiden, THC, 3 diuretica, 4 andere substanties ANAL-108: GC-MS (Full scan); 11 p 12 narcotica, ca 60 stimulantia, 6 aromatase inhibitoren, 5 andere substanties DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

20 Het verhaal van een staal…in het lab
K. Deventer, P. Van Eenoo and F. T. Delbeke. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005; 19: 90–98 K. Deventer, P. Van Eenoo and F. T. Delbeke. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005; 19: 90–98 Het verhaal van een staal…in het lab LC/MS Analyse: 2 Thermo LCQ en 2 Thermo TSQ ANAL-09*: LC-MSn (ESI; polarity switching) 26 diuretica 21 beta-blokkers 8 andere substanties ANAL-30: LC-MSn (ESI; polarity switching) 17 anabole steroiden 18 corticosteroiden 8 aromatase inhibitoren 9 b-agonisten 6 andere substanties * K. Deventer, P. Van Eenoo and F. T. Delbeke. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005; 19: 90–98 DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

21 Het verhaal van een staal…in het lab
EPO en analogen: probleemstelling en mogelijkheden tot detectie DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

22 Het verhaal van een staal…in het lab
Indirect In bloed Statistische modellen op basis van bloedparameters: Hematocriet, reticulocyten, macrocyten %, EPO en SolubleTransferrine receptor Direct In urine Onderscheid EPO, rhEPO en Aranesp op basis van verschillen in koolhydraten DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

23 Het verhaal van een staal…in het lab
Indirect Gezondheidscontroles UCI HCT en Hb > 50 % en > 17 g/dl (♂) ; 47 % en 16 g/dl (♀) %reti (<0,20 %) Stimulatie index = Hb (g/l) - 60 √ reti (%) > 133 (♂) ; 123 (♀) Bloedtransfusie (?) DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

24 Het verhaal van een staal…in het lab
Hematologische testen: synthetisch hemoglobine Plasma Haemolyse Hemopure 325 mg/dl DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

25 Het verhaal van een staal…in het lab
Direct Concentratie/ opzuivering Gelelectroforese Dubbele immunoblotting met selectieve herkenning Chemoluminescentie Verwerking via GASEPO en interpretatie DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

26 Het verhaal van een staal…in het lab
Direct Concentratie/ opzuivering Concentratie EPO: ca 10 ng/L andere proteines 30 mg/L 1000-voudige concentratie 20 ml → 20 µl Filtratie MW 30 kDa Toevoeging protease inhibitoren (complete) DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

27 Het verhaal van een staal…in het lab
Direct Gelelectroforese EPO: isovormen huEPO pI 3,7 – 4,7 rhEPO pI 4,4 – 5,1 Aranesp pI 3,0-3,9 Gel: pH-gradient 2-6 ladingscapaciteit DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

28 Het verhaal van een staal…in het lab
Direct Dubbele immunoblotting Primair AB: R&D-systems kloon AE7A5 DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

29 Het verhaal van een staal…in het lab
Direct Chemiluminescentie en interpretatie Een staal is positief voor rhEPO indien: Minstens 3 opeenvolgende banden worden onderscheiden, overeenkomend met 1, 2, 3 of 4. De 2 meest intensieve van deze banden moeten opeenvolgend zijn, komen overeen met 1,2 of 3 en zijn 2 maal intensiever dan de meest intensieve band in het endogene gebied. Een staal is positief voor Aranesp indien: Minstens 3 banden worden onderscheiden die overeenkomen met B,C en D. De meest intensieve banden moeten overeenkomen met C en D. De meest intensieve band, C of D, moet intensiever zijn dan elke band in het endogene gebied. DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

30 Het verhaal van een staal…in het lab
Homologe bloedtransfusie Bloedtoediening: ABO-systeem, rh(D) Bijkomende antigenen (C; c; E; e; K1 (Kell); K2(Cellano); Fya , Fyb , Jka, JKb, S en s) via flow cytometrie (concentraties) 100% negatief 100% positief mengpopulatie 1% pos DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

31 Het verhaal van een staal…in het lab
hGH : serum Natuurlijk mix 22 kDa-isovormen en non-22 kDa isovormen Recombinant: 22kDa-isovormen Detectieprincipe: 22kDa/alle isovormen via time resolved immuno-assay OS Athene en Torino : geen AF’s DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

32 Het verhaal van een staal…in het lab
Testosteron Endogeen – Exogeen Indirect: testosteron/epitestosteron >4 Natuurlijk verhoogde waarde Vorige waarden Follow Up Ca. 30% variatie mogelijk Direct: 13C/12C DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

33 Het verhaal van een staal…in het lab
Testosteron Direct: 13C/12C Verschil in 13C gehalte van endogeen/farmaceutisch T Ca. 1.1 % alle C in natuur is 13C Endogeen: voeding → acetaat → cholesterol → T Farmaceutisch: uit plantsterolen Alle C komt finaal uit CO2, maar bij elke intermediaire stap naar T is er depletie van 13C DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

34 Het verhaal van een staal…in het lab
Testosteron Direct: 13C/12C via GC/C/IRMS Extractie uit urine Opzuivering via HPLC Scheiding via GC (derivatisatie/ongederivatiseerd) Pyrolyse van C tot CO2 Meten 13CO2 en 12CO2 en vgl met Internat. Std → d-waarden DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

35 Het verhaal van een staal…in het lab
Testosteron Direct: 13C/12C d-waarde T, metaboliet of precursor (Andro/Etio/Adiol) d-waarde endogeen steroid onafhankelijk T (11OHAndro, Pregnandiol) Dd wordt berekend en geëvalueerd Gevolg: invloed dieet (C4 ↔ C3) wordt beperkt DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06

36 Dankwoord Alle collega’s van DoCoLab
Het Departement Cultuur, Jeugd, Sport en Media – Dienst Medisch Verantwoord Sporten van de Vlaamse Gemeenschap DoCoLab – Faculty of Medicine and Health Sciences – GE06