Module DNA1 Waar gaat het om? Apparatuur Techniek en practicum

Presentatie over: "Module DNA1 Waar gaat het om? Apparatuur Techniek en practicum"— Transcript van de presentatie:

1 Module DNA1 Waar gaat het om? Apparatuur Techniek en practicum
DNAlab1: Solanum Module DNA1 Waar gaat het om? Apparatuur Techniek en practicum Resultaten Verslag Module: DNAlab1 Solanum

2 DNAlab1: Solanum Waar gaat het om? Vaststellen of enkele genen die betrokken zijn bij de resistentie tegen phythophtera in de betreffende plant(en) aanwezig zijn. Komen de uitkomsten overeen met hetgeen kwekers van deze rassen ook claimen? Module: DNAlab1 Solanum

3 De techniek DNAlab1: Solanum
Monstername van 5 aardappelrassen. In de vriezer zitten van 5 rassen bladmateriaal: 1. Doré 2. Mona Lisa 3. Mozart 4. Texla 5. Irene 6. Biologische soort. We testen op de aanwezigheid van het R1 gen en het gen R3a. Beide genen zijn gedocumenteerd als betrokken zijnde bij de resistentie tegen phythophtera; er zijn er meer! Eventuele controle of deze genen ook aanwezig zijn in tomaat, erwt etc. Verder.. Module: DNAlab1 Solanum

4 DNAlab1: Solanum De techniek DNA-isolatie Het DNA moet uit het blad worden gehaald. De fabrikant kent twee methoden: directe procedure en de verdunde procedure. Wij nemen de verdunde procedure wegens de hogere betrouwbaarheid. PCR De PCR zal geprogrammeerd worden: fase 1: 5 min 98 graden fase 2: 10 sec 98 graden (40x) sec 52 graden sec 72 graden fase 3: 5 min 72 graden Gel-electroforese in 2% gel. Module: DNAlab1 Solanum

5 DNAlab1: Solanum De Apparatuur Pipetten. Dit zijn dure dingen, vanwege de preciezie waarmee ze werken. Mogelijk zijn er al fixed-volume pipetten aangeschaft. Finn-tips. Deze verbruiken we veel. Een DNA-practicum moet brandschoon zijn. Elke vervuiling met vreemd DNA kan de proef verstoren; erger nog: onbedoeld toevoegen van DNAse kan DNA in no-time afbreken… Pipetpunten kosten een paar cent. Ga ze niet sparen… je andere ingredienten zijn x duurder! Module: DNAlab1 Solanum

6 De Apparatuur PCR: Techne CycloGene
DNAlab1: Solanum De Apparatuur PCR: Techne CycloGene Dit is een apparaat van dik 3000 euro welke de school tijdelijk in bruikleen heeft. Voorzichtig graag. De cycler kan een programma aflopen waarbij gedurende vooraf ingestelde tijden een temperatuur wordt ingesteld. De meeste wachttijd gaat verloren met de overgang van de ene temp naar de andere. Deze cycler kan 96 epjes bevatten. De cycler heeft ook een heated lid; epjes worden aan de bovenzijde verwarmd. Module: DNAlab1 Solanum

7 DNAlab1: Solanum De Apparatuur Vortex. Dit ding is hier gemaakt van een omgekeerde schuurmachine zonder schuurpapier. Hij schudt als een malle en dat is het enige wat ie moet kunnen. Niet bang zijn; hij maakt veel herrie Je schudt vaak maar voor 10 seconden.. O ja… Hou wel de epjes vast… anders worden ze gelanceerd! Module: DNAlab1 Solanum

8 DNAlab1: Solanum De Apparatuur Centrifuge. Deze machine draait (helaas) maar op één snelheid: rpm. Eigenlijk is dat te snel; zou beter zijn. Na testen blijkt het plastic er tegen te kunnen. Glazen buizen knallen stuk. Zorg bij het laden, dat er evenveel massa links als rechts is.. Module: DNAlab1 Solanum

9 DNAlab1: Solanum De Apparatuur De gel-chamber. In deze chamber wordt de agarose-gel gegoten (als ie nog warm is) en het kammetje geplaatst. Als de gel hard is, wordt de kam verwijderd. De chamber wordt op Volt aangesloten en de electrische stroom neemt het DNA mee naar de pluspool. Voor het bekijken van het resultaat, zit in de gel de (giftige) stof EthidiumBromide. Dat kruipt in het DNA en licht op na bestraling met UV. Module: DNAlab1 Solanum

10 De techniek DNA isolatie PCR Gel gieten Gel runnen Resultaat bekijken.
DNAlab1: Solanum De techniek DNA isolatie PCR Gel gieten Gel runnen Resultaat bekijken. Module: DNAlab1 Solanum

11 De techniek DNA ISOLATIE 1
DNAlab1: Solanum De techniek DNA ISOLATIE 1 Gebruik (latex) handschoenen en vermijdt contact met de binnenzijde van de epjes. Neem een leeg epje van 0.2 ml. Neem een Pipet + schone tipjes en piptetteer 20 uL Dilution Buffer (staat klaar) in deze ep. (Dit heb ik al voor je gedaan.) Neem een schoon objectglaasje , een (nieuw) mesje, groen tissue Snijdt óp het glas een stukje bladweefsel uit van 1,5 x 1,5 mm groot. Laat dit in de buffer vallen Neem je pipet punt en crush het blad. Module: DNAlab1 Solanum

12 De techniek DNA ISOLATIE 2
DNAlab1: Solanum De techniek DNA ISOLATIE 2 Als het goed is, toont de oplossing nu een beetje groenig (chlorophyll) Centrifugeer het epje bij rpm gedurende 1 minuut. Zorg voor een epje aan de overzijde van de centrifuge dat nét zo vol is. (tarreren) Neem nu een tweede epje van 0.2 ml Pipetteer hierin eerst 10 uL PCR buffer-mix. (hierin zitten de dNTP’s, zouten en buffers) Pipetteer nu uL van het supernatant (1e epje) in het tweede epje. Module: DNAlab1 Solanum

13 De techniek DNA ISOLATIE 3
DNAlab1: Solanum De techniek DNA ISOLATIE 3 Pipetteer nu 0.5 uL primer A erbij. Druk je pipetpunt tegen de ep-wand zodat de druppel dáár blijft zitten. Doe hetzelfde voor primer B Voeg nu toe 8.5 uL dNase-vrij water toe Vortex heel kort en centrifugeer 20 sec. Voeg nu 0.5 uL taq-DNApolymerase toe en zet deze kleine hoeveelheid ook tegen de epwand. Gezien de hoge prijs van dit spul: ik doe dat wel. Vortex kort en centrifugeer 20 sec. Module: DNAlab1 Solanum

14 DNAlab1: Solanum De techniek DNA PCR 1 Onderstaande procedure zet ik klassikaal in. Het proces neemt 4-5 uur in beslag. Stel de PCR in op programma 20 aanzetten Heated lid aanzetten (achterin!) Druk op [mode] en wacht tot de melding over het gebruik verdwijnt.. Selecteer rechts bovenin nummer 20 Laadt de epjes ergens in de 96 welletje. Start door op [run] te drukken. Controleer even of de temp oploopt naar 98 graden. Je kan nu wat anders gaan doen…. Module: DNAlab1 Solanum

15 De techniek DNA Gel voorbereiden
DNAlab1: Solanum De techniek DNA Gel voorbereiden Je PCR loopt nu dik 4 uur. Die tijd wachten we niet af. De docent zal de verdere verwerking doen. Neem een schone erlenmeyer 250 ml. Pipetteer 80 ml TBE buffer erin (1X) Weeg af op de balans 1,6 gram agarose en voeg die toe. Gebruik de microwave om kort te verwarmen. Kan ook met bunsenbander. Alle agarose moet gesmolten zijn; een heldere oplossing. Dit is nu HEEEL heet. Laat afkoelen tot graden Module: DNAlab1 Solanum

16 De techniek DNA Gel gieten DNAlab1: Solanum
Pipetteer 4 uL Ethidium Bromide in de erlenmeyer met afgekoelde agarose-opl. Giet zonder luchtbellen de agarose in de chamber. Plaats het kammetje bij de markering links en zorg dat dit rechtop staat en ca 8 mm van de linker ‘dam’wand. Zet de bak HORIZONTAAL. Als de gel hard is (na 40 min) kan je damwandjes weghalen. Vul de chamber met dezelfde TBE bufferoplossing (ca 400 ml nodig) als waarmee de gel gemaakt is. Er staat ca 3 mm vloeistof boven de gel, die dus geheel ondergedompeld is. Module: DNAlab1 Solanum

17 De techniek DNA Gel laden DNAlab1: Solanum
Als het klopt, zou na 4-5 uur de PCR wel klaar moeten zijn. Zet de epjes weer in de goede volgorde in het rekje. Voeg aan elk epje 5 uL loading dye toe. Dit bestaat grotendeels uit glycerine en maakt het laden makkelijker doordat dit zwaarder is dan de TBE-buffer in de gel. Vortex all epjes met loading dye. Centrifuge mag, maar is nu niet zo nodig. Neem 3 uL DNAladder in een schone ep en vul aan met 5 uL loading dye en 10 uL water. Vortex even. Pipetteer steeds met schone nieuwe punt uL van elk epje in een welletje. Kies welletje 5 voor de DNA ladder. (centrale positie). Noteer goed waar welke ep-inhoud in gedaan is. Je kan het nergens meer aan zien! Module: DNAlab1 Solanum

18 De techniek DNA Gel runnen DNAlab1: Solanum
De gel is nu geladen met 9 welletjes. Noteer goed wat waar in zit. En verwerk dat ook zo in je verslag. Steek de stekkers erin MIN = LINKS, PLUS = RECHTS. DNA loopt van MIN naar PLUS!!! Stel in op 50 Volt. Na min plug je de stekkers in op 100 Volt. Na 6 kwartier kan je de run stoppen. (foto hiernaast was na 4 kwartier.. Giet de TBE buffer in een afsluitbare bak ( deze kan hergebruikt worden). Neem de gel niet uit de bak; deze bekijken we in het donker met een UV lamp. Maak (als het lukt een foto van het resultaat). Module: DNAlab1 Solanum

19 De techniek DNA Gel bekijken
DNAlab1: Solanum De techniek DNA Gel bekijken Module: DNAlab1 Solanum

20 De resultaten Probeer een foto te hebben van de gel.
DNAlab1: Solanum De resultaten Probeer een foto te hebben van de gel. Op de foto zijn hier en daar bandjes te zien. Met behulp van de DNAladder kan je schatten hoe groot de DNA fragmenten moeten zijn. Sommige bandjes zijn helder, ander soms erg vaag. Een kwestie van hoeveelheid. Noteer goed welke bandjes je waarneemt bij welke wel. Mogelijk zie je twee bandjes in een laantje. Module: DNAlab1 Solanum

21 Het verslag. Je verslag bevat deze onderdelen: Inleiding
DNAlab1: Solanum Het verslag. Je verslag bevat deze onderdelen: Inleiding Doelstelling, verwachting, Materiaal en werkwijze met uitvoerig hoé alles wordt uitgevoerd. Resultaten met digitale foto van de gels. Discussie. Hier bespreek je de resultaten en trek je conclusies. Doe ook voorstellen voor verbetering of alternatieve uitvoeringen van het practicum. Einde. Module: DNAlab1 Solanum