Pathologisch Laboratorium - AZ Sint-Lucas te Gent Jolien Pollet

Presentatie over: "Pathologisch Laboratorium - AZ Sint-Lucas te Gent Jolien Pollet"— Transcript van de presentatie:

1 Pathologisch Laboratorium - AZ Sint-Lucas te Gent Jolien Pollet
Bachelorproef: Validatie van immuunhistochemische kleuring met behulp van multiblokken Pathologisch Laboratorium - AZ Sint-Lucas te Gent Jolien Pollet Goeiemiddag, Ik ben Jolien Pollet 3de jaars student MLT, voor mijn studie te vervolledigen kregen we als opdracht een bachelorproef te maken. Hieraan werd een stage gekoppeld van 10weken in het pathologisch laboratorium in het algemeen ziekenhuis Sint-Lucas te Gent. Van mijn stageplaats kreeg ik het onderwerp: “De validatie van de immuunhistochemische kleuringen met behulp van multblokken.

2 Inhoudstafel Het belang van de validatie Plan van aanpak Resultaten
Accuraatheid Precisie Antilichamen Resultaten CD5, CK-pan, Cyclin D1, Ecad en PAX-5 Besluit

3 Het belang van de validatie
Weefsel verwijderen  opsturen naar pathologisch labo Afwijkingen?  IHC kleuringen aanvragen Resultaat  behandeling bepalen Stukje weefsel bij de patiënt verwijderen  waarna deze wordt opgestuurd naar een pathologisch labo, hier wordt het weefsel onderzocht. Wanneer een afwijking wordt waargenomen, kan er een IHC kleuringen aangevraagd worden. Aan de hand van de kleuringen kan de patholoog veel te weten komen, want men gaat via deze kleuringen opzoek naar specifieke antigenen aan de hand van meerdere antilichamen. Zo kan men bepalen of het om goedaardig-, kwaadaardig carcinoom gaat, maar ook het stadium van de metastase,… Deze kleuringen is dus zeer belangrijk naar het bepalen van de behandeling van de patiënt. Het is zeker cruciaal dat deze antilichamen op de juiste, specifieke antigenen binden.

4 Het belang van de validatie
The CAP (The college of American pathologists) Richtlijnen validatie van de IHC kleuring Accuraatheid Verband tussen oude en nieuwe test Validatieweefsel dezelfde manier behandeld Afzonderlijke validatie cytologische/ontkalkte stalen Enz. Werd door de the CAP (the college of the American pathologists” opgemerkt dat deze kleuring toch gevalideerd moet worden. Zo stelden zij in samen spraak met andere kwaliteitsinstituten enkele richtlijnen op waaraan de validatie van een IHC kleuringen voor klinische diagnostiek moet voldoen. * Er moet een verband zijn tussen de verkregen en de verwachte resultaten. * De resultaten van de nieuwe test moeten vergelijkbaar zijn met deze van voorafgaande gevalideerde test die uitgevoerd werd in het zelfde laboratorium, indien deze aanwezig is. * De resultaten van één zelfde test op het zelfde stukje weefsel worden vergeleken tussen verschillende laboratoria. Dit wordt ook wel methode vergelijking genoemd. * De validatieweefsels moeten op dezelfde manier behandeld worden zoals de klinische routine stalen. (bijvoorbeeld. duur van fixatie, ontkalken,…) * Er moet een afzonderlijke validatie gebeuren voor cytologische of ontkalkte stalen

5 Plan van aanpak Twee specifieke richtlijnen De accuraatheid
De precisie  de inter-run precisie Mits dit de eerste stappen zijn in het valideren van de IHC kleuringen voor klinisch gebruik, wordt er specifiek naar 2 richtlijnen gewerkt; namelijk: De accuraatheid. De precisie, meer bepaald de inter-run precisie

6 De accuraatheid = Hoe dicht ligt de bekomen waarde bij de werkelijke
De accuraatheid  hoe dicht ligt de bekomen waarde bij de werkelijke waarde. Hiermee bedoelt men of het antilichaam de specifieke antigenen aankleurt.

7 Accuraatheid Bekomen waarden vergelijken met richtlijnen van NordiQC
Vier controleblokken  vier soorten weefsel Oplijsting antilichamen Concrete aankleuring Voor aan deze parameter te voldoen, wordt het bekomen resultaat vergeleken met de vooropgestelde richtlijnen door NordiQC. Zij hebben richtlijnen opgestelt om de juistheid van de IHC kleuring in het laboratorium zelf na te gaan. Deze omvatten de aanmaak van vier controleblokken die elk bestaan uit vier verschillende soorten normaal weefsel, die op een specifieke manier reageren met de antilichamen. Zo is voor ieder antilichaam beschreven wat er concreet aangekleurd wordt in de verschillende weefsels.

8 De precisie In dit onderzoek: De inter-run precisie
= Herhaalbaarheid onder verschillende omstandigheden De 2de richtlijn waaraan de kleuring moet voldoen is de precisie: In dit onderzoek wordt de inter-run precisie bepaald; hiermee wordt de herhaalbaarheid onder verschillende omstandigheden bedoelt. Dit door het zelfde weefsel op 3 verschillende dagen te kleuren en na te gaan of alles 3x het zelfde is aangekleurt. Hier wordt dus na gegaan of de antilichamen tijdens 3 verschillende metingen dezelfde specifieke antigenen aankleuren.

9 De antilichamen Vijf antilichamen Enkel controle blok één CD5 (SP19)
CK-pan (AE1/AE3/PCK26) Cyclin D1 Ecad (EP700Y) Pax-5 (SP34) Enkel controle blok één Appendix, Tonsil, Lever, Pancreas De kleuringen die in dit werk behandeld en gevalideerd worden; zijn een beperkte selectie van vijf uit een oplijsting van 94 mogelijke antilichamen. Deze vijf (CD5 (SP19); CK-pan (AE1/AE3/PCK26); Cyclin D1 (SP4-R); Ecad (EP700Y); Pax-5 (SP34)) werden gekozen in samenspraak met de pathologen en de externe bachelorproef begeleider. Maar de keuze werd ook gemaakt op basis van de verkregen referenties van NordiQC. Voor deze 5 antilichaam is enkel controle blok 1 nodig (deze bestaat uit Appendix, Tonsil, Lever en Pancreas)

10 Resultaten CD5 (SP19) CK-pan (AE1, AE3 en PCK26) Cyclin D1 (SP4-R)
Accuraatheid Inter-run precisie CK-pan (AE1, AE3 en PCK26) Aangepaste parameters Cyclin D1 (SP4-R) Ecad (EP700Y) PAX-5 (SP43)

11 Resultaten CD5 - Accuraatheid
Weefsel Verwacht resultaat volgens NordiQC Bekomen resultaat Appendix Alle T-cellen Geïsoleerde T-cellen (centrum appendix) Tonsil Membraan van de T-cellen (uit het kiemcentra) Pancreas Lever De anti-CD 5 kleuring voldoet aan de verwachte resultaten die opgesteld zijn door NordiQC. Zo zijn alle T-cellen voldoende sterk aangekleurd, zonder een storende achtergrond aankleuring.

12 Resultaten CD5 – Inter-run precisie
Drie verschillende runs  geen verschil De kleuring voldoet aan de eisen

13 Resultaten CK-pan - Accuraatheid
Weefsel Verwacht resultaat volgens NordiQC Het bekomen resultaat Appendix Cilindrisch epitheel Mesotheliale cellen Tonsil Squameus epitheel Folliculaire fibroblasten Pancreas De eilandjes van langerhans Lever Cytoplasma van de hepatocyten (Zwak) Appendix  cilindrisch en mesotheliale cellen kleuren aan  zwakke cytoplasmatische aankleuring van de spierlaag van de appendix en bloedvaten Tonsil  het squameus epitheel en de folliculaire cellen kleuren aan  enkel een overkleuring van spierlagen van de bloedvaten Pancreas  cilindrisch epitheel en de eilandjes van langerhans kleuren aan  enkel is er ook een zwakke aankleuring van enkele bloedvaten Lever  De hepatocyten kleuren te sterk aan Hieruit kan besloten worden dat het antilichaam anti-CK Pan over het algemeen te sterk aankleurt. Waardoor het protocol zal aangepast worden.

14 Aangepaste parameters
Incubatie tijd primair antilichaam CC1-buffer – Antigen retrieval Option buffer toevoegen Incubatie tijd primair antilichaam Te sterk + kernen zijn normaal van structuur  incubatie tijd verkorten  minder tijd om op aspecifieke plaatsten te binden Te Zwak  incubatie tijd verlengen  antilichaam meer tijd om te binden CC1 –buffer  antigen retrieval HIER (heat induced antigen retrieval)  coupes in beplaade verwarmde buffer gebracht  Hier worden de coupes in een buffer van pH 8 gebracht, de CC1-buffer. Te Sterk  blootstellingstijd aan de deze buffer verkorten Te zwak  Blootstellingstijd verlengen Option buffer toevoegen = blokkeringsbuffer  aspecifieke epitopen in het weefsel blokkeren  voorkomen van aspecieke aankleuringen  kan gebruikt worden bij een te strekke aankleuring

15 Aangepaste parameters
Andere detectiekit Optiview DAB IHC detectiekit Voordeel Sterker signaal Nadeel Kostprijs Tijdsduur Minder testen in 1 run Aankleuring te zwak  en geen voorafgaande parameter verbetering geeft  overgaan op een andere detectiekit  optiview DAB IHC detectiekit Gebruik van 3 antilichamen Primair Gericht tegen specifiek epitoop Secundair Bindt op het primair antilichaam. Op dit antilichaam is een hapteen gekoppeld. Tertair Deze zal binden op de hapteen van de secundaire antilichaam  aan dit antilichama zijn meerdere enzymen, namelijk horshe radisch peroxidase gebonden via een multimeer methode Daarna worden de enzymen zichtbaar gemaakt door DAB en H2O2 Voordeel Doordat er meerder enzymen gebonden zijn op het ene antilichaam (het tertaire AL)  en er meerder tertaire AL kunnen binden aan de het secundair aantilichaam  wordt er een sterker bruin signaal waargenomen boven 1 epitoop Nadeel Kostprijs Tijdsduur  door de extra stap (ter. AL)  langere run Door de extra stap  meerder dispensers nodig op de Benchmark XT  waardoor er minder verschillende AL tijdens 1 run kunnen gedecteteerd worden

16 Resultaten CK-pan – Na aanpassingen
1ste aanpassing Verkorten van de primaire incubatie tijd Resultaat: Minder sterke aankleuring  nog te sterk 2de aanpassing Verkorten van de voorbehandeling Toevoegen option buffer Resultaat Volledig negatief beeld 1ste aanpassing Verkorten van de incubatie tijd van 12 min naar 8 en 4  minder sterke aankleuring maar nog steeds te sterk 2de aanpassing Door het verkorten van de voorbehandeling (van 30 min naar 8 min) + incubatie tijd van 8 min is ondervonden dat de storende achtergrond verdwijnt maar ook de specifieke aankleuring verdwijnt  volledig neg beeld Ook toevoegen optionbuffer  zelfde negatief beeld als enkel verkorte voorbehandeling  niet meer mee verder werken

17 Resultaten CK-pan – Na aanpassingen
3de, 4de en 5de aanpassing Verkorte voorbehandeling behouden Verlengen incubatietijd primair antilichaam Resultaat Opnieuw sterke achtergrond aankleuring Te zwakke specifieke aankleuring Doordat de storende achtergrond en het bruine specifieke signaal afwezig is bij een incubatie tijd van 8 min is er besloten om de incubatie tijd te verhogen Bij de 3de en 4de aanpassingen (is de incubatie tijd blijven verhogen 12, 20, 24) geen achtergrond aankleuring  maar zwakke specifieke aankleuring Bij de 5de aanpassing (vanaf de 32min incubatie , 36, 40 min) opnieuw storende achtergrond (spierlagen kleuren opnieuw aan) maar zwakke specifieke

18 Resultaten CK-pan – Na aanpassingen
6de aanpassing Overgaan Optiview DAB IHC detectiekit Resultaat Geen achtergrond aankleuring Sterke specifieke aankleuring Doordat de storende achtergrond aankleuring terug wordt waargenomen en de specifieke aankleuring te zwak is  besloten om over te gaan op andere detectie kit (optiview DAB IHC detectiekit) Geen achtergrondkleuring + sterke specifieke aankleuring

19 Resultaat CK-pan – Inter-run precisie
Drie verschillende runs  kleine variatie waargenomen De ene  optimaal De andere  Aspecifieke aankleuring t.h.v. de tonsil Toch een stuk beter dan origineel Kleine variatie tussen de 3 runs De eerste test = optimaal zonder storende achtergrond De 2de en 3de test = wordt er een aspecifieke aankleuring waargenomen bij de tonsil  aankleuring van de bloedvaten Afgezien van deze aspecifieke aankleuring is de CK-pan kleuring met het optiview protocol al een stuk beter dan het origineel protocol.

20 Resultaten Cyclin D1 - Accuraatheid
Weefsel Verwacht resultaat Volgens NordiQC Bekomen resultaat Appendix Enkele basale cilindrische cellen uit epitheel Tonsil Enkele fibroblasten Kernen van de parabasale squameuze epitheelcellen. Pancreas Enkele basale cilindrische cellen Lever Geen bruine kleur Appendix  Enkele basale cellen zin aangekleurd Tonsil  Matige tot sterke aankleuring van de kernen het squameus epitheel Pancreas  Enkele basale cellen zijn aangekleurd Lever  enkele sinusoïdale cellen kleuren aan Ondanks de aankleuring t.h.v. lever wordt de kleuring door de patholoog als optimaal beschouwd  besluiten Cyclin D1 voldoet aan verwachter resulaten

21 Resultaten Cyclin D1 – Inter-run precisie
Drie verschillende runs  geen verschil De kleuring voldoet aan de eisen Wanneer de inter-run bekeken wordt, kan er vastgesteld worden dat er geen verschil is in aankleuring tussen de aparte runs. Zo wordt er bijvoorbeeld bij elke kleuring de aankleuring van het epitheel van de appendix waargenomen.

22 Resultaten Ecad – Accuraatheid
Weefsel Verwacht resultaat volgens NordiQC Bekomen resultaat Appendix Membraan van het cilindrisch epitheel Tonsil Membraan van het squameus epitheel Pancreas Lever Zwakke membraneuze aankleuring van de hepatocyten Appendix, Tonsil  Membraan is mooi bruin aangekleurd  Storende achtergrond aankleuring + enkele lymfocyten kleuren aan Pancreas Membraan mooi aangekleurd  Cytoplasma kleurt ook bruin aan Lever  De hepatocyten zijn iets te sterk aangekleurd  + zwakke cytoplasmatische aankleuring Ondanks de mooie membraneuze aankleuring  Is de achtergrond aankleuring storend  de kleuring is te sterk waardoor het protocol aangepast wordt door enkele paramaters aan te passen zoals bij de CK-pan kleuring

23 Resultaat Ecad – Na aanpassingen
1ste en 2de aanpassing Idem CK-pan 3de, 4de, 5de en 6de aanpassing Verkorte voorbehandeling behouden Incubatie tijd verlengen Resultaat Te zwakke specifieke aankleuring Geen achtergrond aankleuring Doordat de storende achtergrond en het bruine specifieke signaal afwezig is bij een incubatie tijd van 4 min is er besloten om de incubatie tijd te verhogen Bij de 3de, 4de, 5de en 6de aanpassingen (is de incubatie tijd blijven verhogen 8  40min )  geen achtergrond aankleuring  maar zwakke specifieke aankleuring

24 Resultaat Ecad – Na aanpassing
7de aanpassing Overgaan Optiview DAB IHC detectiekit Resultaat Sterke specifieke aankleuring Terug achtergrond aankleuring (lymfocyten) Verder optimaliseren niet gerealiseerd Toekomst Na overleg is er besloten dat een protocol van 40minuten (of langer) niet meer haalbaar is voor routine onderzoek. Waardoor er wordt overgegaan op een andere detectiekit, namelijk de optiview DAB IHC detectiekit. Echter wordt er terug een aspecifieke aankleuring waargenomen, zo kleuren er opnieuw enkele lymfocyten aan ter hoogte van de appendix en de tonsil. Zodoende er kan besloten worden dat het uitgevoerde protocol met de optiview detectiekit niet bruikbaar is. Het verder optimaliseren van deze kleuring kan niet meer gerealiseerd  Maar wordt in de toekomst verder geoptimaliseerd.

25 Resultaat Pax-5 – Accuraatheid
Weefsel Verwacht resultaat Volgens NordiQC Bekomen resultaat Appendix Alle B-cellen   Tonsil Alle B-cellen Kernen van de B-cellen die in het kiemcentra Plasma cellen niet aangekleurd Pancreas Geen aankleuring Lever Geen bruine kleur Zowel bij de appendix als bij de tonsil kleuren alle B-cellen aan Bij de pancreas  wordt er geen bruin signaal waargenomen Lever  Wordt er vermoedelijk een zeldzame B-cel aangekleurd  dit is geen probleem waardoor de kleuring door de patholoog als optimaal wordt beschouwd.

26 Resulaat Pax-5 – Inter-run precisie
Drie verschillende runs  geen verschil De kleuring voldoet aan de eisen Wanneer de resultaten van de drie runs met elkaar vergeleken worden, wordt hier geen verschil waargenomen. Bij elke kleuring wordt er een aankleuring waargenomen bij de appendix, tonsil en lever

27 Besluit Vier van vijf antilichamen
Drie antilichamen  voldeed het origineel protocol één antilichaam (CK-pan)  voldoet na optimalisatie Detectiekit kent enkele nadelen Variatie inter-run  toch optimaal Protocol doorvoeren 3 antilichamen (CD5, Cyclin D1 en Pax5)  voldeed het orgineel protocol aan beide parameters. Ondanks de aspecifieke aankleuring van de antilichamen Cyclin D1 en Pax5  worden beiden door de patholoog als optimaal beschouwd Het vierde antilichaam (CK-pan)  voldoet na optimalisatie van de kleuring  dit door over te schakelen op een andere detectiekit echter kent dit zijn nadelen (zoals de tijdsduur, aantal despensers,…) Ook is er een probleem ter hoogte van inter-run precisie, waarbij er kleine variatie is tussen de verschillende testen  Na overleg wordt er toch gekozen om dit protocol door te voeren want met dit protocol is er een veel specifiekere aankleuring dan het origineel Dit nieuwe protocol kan doorgevoerd worden door de testen overnacht uit te voeren of langere runs overdag te draaien  dit wordt later besproken op de personeelvergadering

28 Besluit Vijfde antlichaam (Ecad)  niet voldoende geoptimaliseerd
Ecad + andere antilichamen Toekomst verder geoptimaliseerd en gevalideerd Na valideren: Valideren loont zeker de moeite Zeker specifiek antigen aankleurd Correcte diagnose + snelle behandeling Het vijde antilichaam (ecad)  is na vele testen nog niet voldoende geoptimaliseerd  deze en nog andere antilichamen worden in de toekomst verder geoptimaliseerd en gevalideerd door gebruik te maken van de aangemaakte controle blokken Na het optimaliseren en valideren kan er met zekerheid besloten worden dat de antilichamen de specifieke antigenen aankleuren  waardoor een correctie diagnose kan gesteld worden en hiervoor een snelle geschikte behandeling kan gekozen worden. Waardoor het optimaliseren en walideren van de IHC zeker de moeite loont

29 Bedankt voor jullie aandacht!

30 NordiQC Deense organisatie Kwaliteit IHC kleuringen verbeteren Door:
Vb. protocols Epitopen Technische oplossingen EQC Methode vergelijkingen Voldoet aan de eisen  eventueel wijzigen voorstellen Richtlijnen accuraatheid

31 The CAP The college of American pathologists
Gecertificeerde pathologen Pathologen Patiënten Praktisch werk in pathologische labo verbeteren Door: Inspecties/accreditaties Richtlijnen opstellen (validatie IHC)

32 IHC Antigenen opsporen met antilichamen Antilichaam + tracer
Fluorochroom, enzyme,… Twee methoden Directe Indirecte Signaal amplificatie Speficieke antigenen in of op de cellen opgespoort door gebruik te maken van een antilichaam waaraan een tracer gekoppeld is (dit kan een fluorochroom zijn of een enzyme)  adhv van deze tracer wordt het antigen zichtbaar onder de microscoop Deze techniek kant 2 basis principes de directe en indirecte method Directe  Hier maakt men gebruikt van 1 antilichaam waaraan een tracer is gebonden  deze wordt onmiddellijk geincubeert met het weefsel waardoor het antigen onmiddellijk zichtbaar word Indirecte methode maakt men gebruik van 2 (primair en secundair)  Het primair wekt men op door het antigen in te spuiten in bv konijn  waarna men dit primair antilichaam in spuit in bv een geit  Aan dit sec. al wordt een tracer gekoppeld  Het primair antilichaam wordt geincubeerd met het weefsel en zal binden op het antigen  daarna wordt het secundair antilichaam toegevoegd die zal binden op het FC gedeelte van het primair antilichaam en deze zorgt er voor dat het antigen zichtbaar wordt Er wordt voornamelijk gekozen voor de indirecte methode want deze heeft een sterkere signaal amplificatie  want er wordt meer signaal waargenomen boven epitoop dan de directe methode

33 Aanmaak Antilichamen 1: Immunisatie van het dier  Antigenen in het dier inspuiten zodat er in het dier antilichamen gevormd worden tegen de verschillende epitopen vanop het antigen 2: Het bloed van het dier wordt getest op aanwezig van de antilichamen (gericht tegen de epitopen)  Wanneer deze aanwezig zijn wordt de milt bij het dier verwijdert  worden de B-cellen vrijgemaakt (door de mixen) = ontstaat een polyklonaal antiserum want in de milt zitten verschillende B-cellen gericht tegen de verschillende epitopen van op het antigen 3: Deze B-cellen wordt op een voedingsmedium  maar op dit medium worden ook tumorcellen gebracht  Deze zullen fuseren (door toevoegingen van een polyetyleenglycol (PEG)  en vormen hybridomacellen (4: De niet gefuseerde B-cellen worden verwijderd (doordat deze zullen afsterven  korte levensduur)) (5: De niet gefuseerde tumorcellen zullen afsterven wanneer deze op een HAT medium worden geplaatst  enkel de hybridomas zullen overleven) 6: Elke bekomen hybidomacel wordt in een afzonderlijke well (van een well plaat geplaats die medium bevat)  om deze afzonderlijk van elkaar te laten groeien  iedere wel bevat nu een afzonderlijke cel die dus één type antilichaam vormt tegen één epitoop op het antigen = monoklonaal 7: Van elke well wordt er nu na gegaan of deze antilichamen binden op de epitopen van het antigen  dit door de antilichaam toe te voegen in andere well-plaat waarbij het antigen aanwezig is  de bekomen antilichamen die positief testen (dus binden op het specifiek antigen)  worden verder gekweekt