Presentatie titel Rotterdam, 00 januari 2007 Cursus Genklonering GKL11 Les3: expressievectoren Rotterdam, september 2010
Expressie in bacteriën: pET vectoren T7 polymerase moet door gastheercel worden gemaakt !!
Vector CMV= diervirus T7 = faag dus geen transcriptie in diercellen !! Bovine Growth Hormone mRNA is zeer stabiel SV40 early gene mRNA is zeer stabiel SV40 ori maakt episomale Replicatie mogelijk Neomycinephosphotransferase: fosfaatgroep inactiveert neomycine
SV40 ori (lees ook “Lodish”) SV40 ori functioneert alleen na binding van het Large T antigen eiwit. Alleen in cellen die LargeT tot expressie brengen blijft een circulaire vector met SV40 ori episomaal
Retrovirus genoom 3’LTR 5’LTR Promoter / enhancer Integratie-sequentie Long Terminal Repeat
Retrovirus genoom 3’LTR 5’LTR Capside eiwit Reverse transcriptase Envelop eiwit Packaging Signaal ψ
Retrovirale vectoren en packaging Pol en Env eiwitten worden vanaf twee extra aparte plasmiden/vectoren tot expressie gebracht om risico op ongecontroleerde vorming van recombinante virusdeeltjes minimaal te houden
pBABE puro
Agrobacterium tumefaciens: tumorgenese op de plant
Gen introductie in planten
Eindopdracht GKL11 1. Maak een kloneerschema voor een gen naar keuze waarbij het gen bij voorkeur een relatie heeft met je stage of (geplande) afstudeeropdracht. 2. Je ontwerpt de subklonering vanuit cDNA of een bestaand plasmide (als dat er naar jouw weten is). 3. Je ontwerpt hiervoor een PCR amplificatie. 4. Je volgt het stappenplan uit de modulewijzer GKL Je maakt een schema voor de subklonering mbv PCR met RE-site- bevattende primers naar een kloneervector en vanuit die kloneervector naar een expressievector die geschikt is voor transformatie en genexpressie in diercellen of plantcellen. 6. Je legt voor elke stap duidelijk uit hoe je je keuze hebt gemaakt en laat daarbij gebruikte informatie of resultaten van analyses mbv gebruik van software zien, zodat de docent kan beoordelen of je keuze terecht is. 7. Je levert de eindopdracht in week 8 van onderwijsperiode 1 in; uitgeprint in het postvak van de docent èn als bestand per Opdrachten worden gecontroleerd op plagiaat m.b.v. Ephorusplagiaat