Thema 2.4 Gen-technologie DEEL 1 Genetica

1 gentechnologie Biotechnologie en Klassieke biotechnologie  DNA wordt niet aangetast Selectief kruisen (fokken, veredelen) Gebruik van micro-organismen in voeding (bier, brood, wijn, kaas, youhurt, …  Beperkingen! Soortbarrière, duurt lang Moderne biotechnologie of gentechnologie Genetisch gemodificeerde organismen (ggo) Soortbarrière kan doorbroken worden Sneller Steeds de gewenste eigenschap

Klassieke biotechnologie Gentechnologie

2 genenoverdracht 2.1 Genenoverdracht door bacteriën Natuurlijke genenoverdracht 2 2.1 Genenoverdracht door bacteriën 2.1.1 Het genetisch materiaal van bacteriën Grote ringvormige DNA-molecule  vitale proteïnen Kleine ringvormige plasmiden (DNA)  niet-essentiële proteïnen

Kopieën van plasmiden kunnen door conjugatie overgedragen worden naar andere bacteriën (via een cytoplasmabrug of pilus) Toepassing: overdracht van antibiotica-resistentiegenen

2.1.2 Genenoverdracht van bacterie naar plant De bodembacterie Agrobacterium tumefaciens kan planten via wondjes infecteren  tumorvorming door Ti-plasmide

2.2 Genenoverdracht door virussen 2.2.1 Genetische afhankelijkheid bij virussen Virus  DNA of RNA omgeven door eiwitmantel  geen eigen metabolisme  voor voortplanting afhankelijk van gastheer 2.2.2 Genenoverdracht van virus naar bacterie Bacteriofagen (‘faag’)

Levenscyclus van bacteriofagen:  lytische en lysogene fase

2.2.3 Genenoverdracht van virus naar mens DNA-virussen rhino, hepatitis B wratten herpes, … RNA-virussen Viraal RNA wordt rechtstreeks overgeschreven tot virusproteïnen griep, polio, mazelen, ebola, hondsdolheid, … Herpes simplex ebolavirus

2. Viraal RNA wordt door omgekeerde transcriptie 2. Viraal RNA wordt door omgekeerde transcriptie omgezet tot viraal DNA (provirus) dankzij het reverse-transcriptase enzyme. Het provirus wordt dan geïntegreerd in het DNA van de gastheer.  retrovirus bv. aids, deltaretrovirus (leukemie)

3 genenoverdracht Kunstmatige DNA gericht overbrengen van ene naar andere organisme ggo (genetisch gemodificeerd organisme) = transgeen Genetische modificatie ‘fluo-gen’ DNA verkrijgen en manipuleren  rol restrictie-enzymen DNA transporteren  vectoren : plasmiden, virussen, …

3.1 Enzymen voor kunstmatige genoverdracht 3.1.1 Restrictie-enzymen Bacteriën beschermen zich tegen fagen met restrictie-enzymen ‘moleculaire scharen’ Restrictie- of knipenzymen herkennen bepaalde DNA-sequenties en knippen die door. Sommige basen zijn na het knippen niet meer gepaard met een complementaire base en vormen ‘sticky ends’ sticky-ends vormen een palindroom

3.1.2 DNA-ligasen Geknipte DNA fragmenten (met sticky-ends) moeten ingeplakt worden in een transportmiddel (bv. plasmide) Het transportmiddel wordt met hetzelfde restrictie-enzyme open geknipt  complementaire sticky-ends DNA-ligase plakt nucleotiden aan elkaar

3.2 Transport van DNA bij kunstmatige genoverdracht Vectoren: natuurlijk DNA als transportmiddel  plasmiden  recombinante virussen Liposomen: micro-vetdruppeltjes Micro-injectie: genen rechtstreeks in celkern Elektroportatie: korte stroomstoot Genenkanon: genen worden op goud-, wolfram of zilverbolletjes geplakt

3.3 Verloop van kunstmatige genoverdracht Probleem: gen tot expressie brengen  het regulatiemechanisme van het gen moet het gen vergezellen.

3.4 Genome editing ‘Bewerken’ van het genoom Stukjes DNA gericht veranderen  ‘gunstige mutatie’ (gebeurt ook in de natuur, maar veel trager en ongericht) Toepassing: wegknippen van hiv-DNA-fragmenten uit cellen van seropositieve personen  herstel ipv onderdrukken van aids

4 gentechnologie 4.1 Gentechnologie in de geneeskunde Toepassingen van Productie van belangrijke proteïnen (bv. Insuline) Vroeger: uit weefsels Nu: door transgene cellen in vitro  bacteriën  gistcellen  zoogdiercellen  door transgene dieren in vivo

4.1.1 Productie van insuline door transgene bacteriën en gisten

4.1.2 Productie van hepatitis B-vaccin door transgene gisten 1969: eerste vaccin  verzwakt virus  nog (klein) risico op de ziekte 1986: gentechnologisch vaccin  enkel één proteïne uit de virusmantel die een immuunrespons oproept zit in het vaccin  geen risico meer

4.1.3 Gentherapie: gentransplantatie bij de mens Inbrengen van een therapeutisch gen (via vector) Proteïne wordt aangemaakt door de patiënt zelf en niet door transgene cellen Probleem: therapeutisch gen in voldoende doelwitcellen brengen

Genezende effecten door gentherapie genadditie: ontbrekend gen toevoegen gencorrectie: therapeutisch gen neemt functie defect gen over  gencontrole: gen blokkeert expressie van foute gen   

Voorbeeld van gencorrectie: behandeling van ADA-SCIDS (tekort aan adenosine desaminase) Severe Combined Immune Deficiency Syndrome

4.2 Gentechnologie in de veeteelt Bij varkenspest worden alle varkens binnen een perimeter van de besmettingshaard afgemaakt Ook gezonde en klassiek gevaccineerde varkens  ze zijn niet te onderscheiden van besmette varkens Met nieuw merkervaccin kunnen gevaccineerde varkens met een diagnostische test herkend worden

4.3 Gentechnologie in het milieubeheer 4.3.1 Afvalbeheer Bepaalde bacteriën kunnen radioactieve stoffen uit grondwater halen  bacteriegenen overgebracht in bomen  nemen vervuild H2O op Genen van zoetwaterbacteriën die ruwe olie kunnen afbreken kunnen overgebracht worden naar zoutwaterbacteriën  kunnen ook olie afbreken Biologisch afbreekbare plastics door bacteriën of gisten

4.4 Gentechnologie in de landbouw en voedingsindustrie 4.4.1 Insectenresistente gewassen Gen voor insectentoxine van Bacillus thuringiensis (Bt) overbrengen naar planten via tumor-inducing-plasmide (Ti) van Agrobacterium tumefaciens (volgende dia) Bt-tabak BT-maïs ( stengelboorder) Bt-katoen ( rups) Bt-aardappel ( coloradokever)

Gen voor Bt-toxine van B. thuringiensis naar plasmide van E. coli

4.4.2 Herbicidentolerante gewassen Planten (o.a. soja) ongevoelig maken voor bepaald herbicide

4.5 Pro en contra gentechnologie Betere geneesmiddelen Veiligere vaccins Betere voedselopbrengst Milieuvriendelijker landbouw Ziekten opsporen makkelijker Milieubeheer … Beursgenoteerde bedrijven Wensen van ouders i.v.m. geslachtbepaling, fysieke eigenschappen, … Biodiversiteit? Ontstaan van resistentie? Dure technologieën  arme landen en boeren?

5 technieken Gentechnologische Basistechnieken in de biotechnologie PCR: polymersase chain reaction DNA-sequencing DNA fingerprinting Southern blotting In situ hybridisatie Klonen Knock-outmodel

5.1 Polymerase chain reaction (PCR) Repetitief aanmaken van een welbepaald DNA-fragment Een specifiek gekozen DNA-fragment kan massaal vermenigvuldigd worden (in PCR-cycler) De aanmaak van de complementaire ketens start telkens vanaf een primer (korte stukjes enkelstrengs-DNA) De techniek verloopt in 3 opeenvolgende temperatuurcycli: denaturatie renaturatie polymerisatie ± 95 °C scheiden van DNA-strengen 40-60 °C aanhechten van primers ± 72 °C aanmaak nieuwe DNA-streng

Denaturatie: Dubbelstreng wordt enkelstreng door t° op 95°C te brengen H-bruggen verbroken Renaturatie: t° daalt tot 40-60°C  Aanhechten van forward en reverse primer (5’  3’) Polymerisatie: t° naar 72°C Toevoegen van Taq-polymerase  Aanhechten van vrije nucleotiden vanaf startpunt (primer)

Van DNA-fragmenten met overtollig DNA naar gewenste DNA-dubbelstrengen  na 15 cycli is al meer dan 99,9% gewenst DNA totaal aantal cycli: 30-40

(60° C) na 30 cycli: ± 1 073 741 824 fragmenten :

5.2 DNA-gelelektroforese DNA-fragmenten sorteren op lengte Gel gieten in elektroforesekamer + kam plaatsen  slotjes DNA-stalen opzetten + laadbuffer (met bv. Orange G) Migratie van DNA door spanningsverschil (fosfaatgroep neg. geladen)  DNA zichtbaar maken met positief geladen kleurstof + lengte van de fragmenten kan geschat worden door te vergelijken met DNA-ladder

A B C D E

5.3 DNA-sequencing 5.3.1 Klassieke ketenterminatiemethode Bepalen van de basensequentie in een DNA-fragment (na PCR en gelelektroforese) 5.3.1 Klassieke ketenterminatiemethode Vergelijkbaar met PCR, maar er worden gekende stopnucleotiden toegevoegd (ddA-ddC-ddG-ddT) (zonder OH-groep aan 3’) Waar het kopiëren van de enkelstreng stopt zit een gekende stopnucleotide  de nucleotide op de oorspronkelijke streng is dan ook gekend (bv. stop met ddA  T in oorspronkelijke streng) Toepassing: basensequentie van het onderzochte gen vergelijken met een normaal, ’gezond’ gen  opsporen van genmutaties

5.3.2 Automatische basensequentiebepaling Stopnucleotiden worden gemerkt met een fluorescente merker Merker wordt tijdens de elektroforese (in capillairen) gededecteerd door een sensor  elektroferogram

5.4 DNA fingerprinting 5.4.1 Short tandem repeats (STRs) Korte stukjes repetitief DNA Aantal herhalingen (repeats) is verschillend per individu: DNA-polymorfismen Vb: 7 herhalingen 8 herhalingen AATG Het aantal herhalingen is variabel voor verschillende personen.

5.4.2 Restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP) DNA-stalen knippen met specifieke restrictie-enzymen Fragmenten vermeerderen met PCR Fragmenten scheiden o.b.v. lengte met elektroforese Bandenpatroon is voor ieder individu uniek Toepassingen: dader-identificatie speeksel haar bloed sperma

Kans op een toevallige match AmpFlSTR® Identifiler™ D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1PO D3S1358 TH01 D13S317 D16S539 D2S1338 D19S433 D18S51 TPOX VWA AMEL D5S818 FGA GS500 LIZ size standard 6FAM (blue) VIC (green) Kans op een toevallige match Kans dat “niet verwante” uit een populatie dit profiel vertoont is 1 op 200 miljoen miljard ~1 in 2 x 1017 NED (yellow) Geslachtsmerker: MAN In DNA profiel AMEL: X , Y PET (red) LIZ (orange)

vaderschapsbepaling fingerprint kind, moeder, mogelijke vaders overeenkomstige banden van moeder en kind identificeren resterende banden moeten van de biologische vader zijn

5.5 Southern blotting Techniek om een specifiek DNA-fragment op te sporen in een massa DNA Uitvinder: Edwin Southern Gebruikt om o.a. erfelijke diagnoses te stellen Verschillende technieken worden gecombineerd DNA knippen met restrictie-enzymen Gelelektroforese van de fragmenten Denaturatie van de fragmenten (enkelstrengig maken) Fragmenten vastzetten op nitrocellulosemembraan Hybridisatie met radioactieve probe met een complementaire basensequentie aan het op te sporen DNA-fragment Enkel de radioactieve DNA-fragmenten worden vastgelegd op gevoelige film

5.6 In situ hybridisatie Lokalisatie van een specifiek gen of DNA-fragment FISH: fluorescentie in situ hybridisatie Prenatale diagnostiek bv. trisomie 21 Opsporen van deleties, duplicaties of translokaties

5.7 Therapeutisch klonen 5.7.1 Stamcellen Lichaamscellen produceren, uitgaande van stamcellen Persoonsspecifieke weefsels maken die na transplantie geen afstotingsverschijnselen zullen vertonen 5.7.1 Stamcellen Totipotente stamcellen Pluripotente stamcellen Embryonale stamcellen Multipotente stamcellen Adulte stamcellen Zygote en blastomeren na eerste klievingsdelingen Kunnen uitgroeien tot volledig organisme Cellen uit de embryoblast (na ivf uit ‘restembryo’) Kunnen differentiëren tot alle celtypes Aanwezig in veel weefsels voor weefselherstel (bv. in beenmerg) Genereren alleen celtypes van het eigen weefsel

5.7.2 Multipotente Adulte Progenitorcellen (MAP) Voorlopercellen in spieren, hersenen, beenmerg, botweefsel en pancreas Kunnen geherprogrammeerd worden zodat ze embryonale stamcellen vervangen Minder morele bezwaren (geen embryo’s nodig) Ontdekt door prof. Catherine Verfaillie

5.7.3 Verloop van therapeutisch klonen Mogelijke (toekomstige) toepassingen huidtransplanten bij brandwonden ß-cellen in pancreas neuronen aanmaken om Alzheimer te behandelen hartspiercellen aanmaken na hartinfarct beenmergcellen aanmaken tegen leukemie

5.7.4 Synthese van stamcellen uit lichaamscellen Eigen lichaamscellen worden geherprogrammeerd tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) Er moeten dan geen stamcellen meer worden ‘geoogst’ Nog in onderzoeksfase (klinische studies) Zouden toch niet zo ongedifferentieerd zijn als embryonale stamcellen Men zou op termijn ei- en zaadcellen op deze manier kunnen produceren (onvruchtbaarheidsproblemen)  lukt al bij muizen

5.7.5 Het knock-outmodel De functie van één gen achterhalen door het gen (in proefdieren) uit te schakelen Belangrijk om erfelijke ziekten te bestuderen Knock-outgen injecteren in blastocyst van een muis

Knock-outmuizen

einde