Presentatie titel Microscopie Campbell H6.1 Reed H28, 29 Rotterdam, 00 januari 2007 Rotterdam, augustus 2013, Gebaseerd op Campbell et al (2011) Biology, 9th edition, Pearson

Opbouw van de les Waarom microscopie? Bouw van een helderveld lichtmicroscoop Wat zijn resolutie, contrast en scherptediepte? Contrastversterking door kleuring (algemeen/differentieel), fasecontrast , donkerveld Resolutie en numeriek apertuur Resolutievergroting door kleinere afstand preparaat-objectief, immersieolie, electronenmicroscopie (TEM) 3D door confocale microscopie en SEM

De noodzaak van een microscoop http://www.vce.bioninja.com.au/aos-1-molecules-of-life/cells/

Opbouw van de les Bouw van een helderveld lichtmicroscoop

Lichtmicroscoop HLO BML Robert Hooke (1667) Antonie van Leeuwenhoek (1674) HLO BML

Lichtmicroscoop HLO BML Resultaten met een replica (TU Eindhoven, groep Prof. Kroesen) : keukenzout kristallen HLO BML

Lichtmicroscoop HLO BML Resultaten met een replica (TU Eindhoven, groep Prof. Kroesen) : doorsnede zonnebloemwortel HLO BML

Opbouw van een microscoop

Doorvallend licht: helderveld

Nat preparaat E.coli Weinig Contrast Weinig Resolutie HLO BML

Opbouw van de les Wat zijn resolutie, contrast en scherptediepte?

Wat is contrast? Hoog contrast, weinig licht passeert het object Laag contrast, veel licht passeert het object HLO BML

Resolutie: de mate waarin twee losse punten nog afzonderlijk kunnen worden waargenomen (= oplossend vermogen)

scherptediepte http://www.pietel.be http://en.wikipedia.org/wiki/Depth_of_field

Effect door scherptediepte achter midden voor Medlibrary.org/medwiki/focus_stacking

Opbouw van de les Contrastversterking door kleuring (algemeen/differentieel), fasecontrast , donkerveld

Contrast versterking in lichtmicroscopie Kleuringen in combinatie met eenvoudige lichtmicroscoop Algemeen (methyleen blauw) Specifiek: organellen (flagel, endosporen) Specifiek: differentieel (gram, zuurvast) Toegepast bij bacterie-, en schimmel-preparaten Fasecontrast microscoop Toegepast bij alle cellen Donkerveld microscoop Toegepast bij kleine bacteriën (mycoplasma) en dunne bacteriën (spirocheten/spirillen) Diafragma bij doorvallend licht iets dichtdraaien (tot 80% van de NA) HLO BML

Algemeen: Methyleen blauw HLO BML

Differentieel: Gram kleuring Lugol

Fasecontrast Faseverschillen worden gemanipuleerd tot intensiteit verschillen HLO BML

Fasecontrast/helderveld licht fasecontrast Saccharomyces cerevisiae (bakkersgist) HLO BML

Donkerveld Er wordt niet gekeken naar doorvallend licht maar naar gereflecteerd licht Dit wordt vooral toegepast bij zeer kleine/dunne bacterien, met name spirillen en spirocheten HLO BML

Borrelia burgdorferi (ziekte van Lyme) Donkerveld Borrelia burgdorferi (ziekte van Lyme) HLO BML

Fasecontrast/donkerveld licht fasecontrast donkerveld Saccharomyces cerevisiae (bakkersgist) HLO BML

Opbouw van de les Resolutie en numeriek apertuur

Numerieke apertuur N = de brekingsindex v/h medium om de lens (1,0 voor lucht, 1,33 voor water, 1,56 voor olie) Θ = de grootste invalshoek ten opzichte van de normaal (loodrechte door het lensoppervlak) Hoe groter de numeriek apertuur (NA of An)(formule niet onthouden)... hoe groter de hoek van de lichtstralen die nog worden opgevangen door het objectief... hoe meer lichtstralen worden gebruikt voor het maken van een beeld... hoe scherper het beeld (resolutie) !

Opbouw van de les Resolutievergroting door kleinere afstand preparaat-objectief, immersieolie, electronenmicroscopie (TEM)

Resolutie versterking in lichtmicroscopie Immersie-olie verhoogt brekingsindex Kwaliteit/breedte vd lens vergroot lichtopbrengst Sterke lens geeft brandpuntafstand dichterbij de lens, dus vergroot lichtopbrengst HLO BML

Grotere vergroting op zich geeft geen hogere resolutie

Hogere numerieke apertuur (hier: kleinere afstand lens-object) geeft wèl hogere resolutie

Welke foto heeft een hogere resolutie?

Resolutie en golflengte/deeltjesgrootte: electronenbundel geeft hogere resolutie dan licht

Opbouw van een electronen microscoop

Lichtmicroscopie / Elektronemicroscopie

Opbouw van de les 3D door confocale microscopie en SEM

Opbouw van een scanning electronen microscoop

Figure 26.2 Examples of images of a similar specimen (the stomatal complex of Commelina communis) obtained using different microscopic techniques: (a) light microscopy (surface view); (b) transmission electron microscopy (transverse section through guard cell pair at mid pore); and (c) scanning electron microscopy (surface view). As an indication of scale, the width of a single guard cell is about 10 mm

Verschillende microscopietechnieken vereisen een andere fixatie / ‘kleuring’