Cytogenetica Visualiseren van de chromosomen Chromosomen slechts zichtbaar in delende cellen (in M-fase): T-cellen uit bloed stimuleren in cultuur (vb met phytohemaglutinine) of foetale cellen M-fase is kort (zie figuur), mitotische index Mitotische index ↑ spindel blokkeren colcemid Andere techniek thymidine beperking, en release = gesynchroniseerde cycli  optimalisatie  prometafase  minder condens dan metafase

Cytogenetica Vroeger klassificatie van chromosomen op basis van grootte en positie van centromeer, nummering van lang naar kort Invoeren van banding technieken: sluitende identifactie van chromosomen en identificatie van posities op chromosomen Verschillende banding technieken, geven info over structurele organisatie (resolutie 1-10 Mb) Karyotype 46XX of 46XY en eventuele abnormaliteiten Down-syndroom  trisomie

Banding technieken G-banden Q-banden R-banden T-banden C-banden trypsine digestie  Giemsa stain  G-banden donker, bleke banden G negatief Q-banden Fluorescente AT-rijke DNA binder (Quinacrine, DAPI, Hoechst 33258) UV-fluorescentie  Q-banden zelfde als G-banden R-banden Reverse G-banden  hitte behandeling denatureerd AT-regios voor Giemsa stain. Zelfde patroon met GC-specifieke kleuren T-banden Subset van R banden nabij de telomeren, T-banden zijn de meest intense R-banden  extreme hitte behandeling gevolgd door Giemsa stain C-banden Kleuren van de centromeren  denatureren met barium hydroxide gevolgd door Giemsa stain

Banding-patronen De bindingsverschillen die aan de basis van de banden  verschillen in de scaffold-loop structuur zie figuur Scaffold attachment regios (SARs) Meer SARs per lengte eenheid in G banden dan in R banden  G banden kleinere loops

Karyogram

In situ hybridization Chromosoom in situ hybridisatie Weefsel in situ hybridizatie

Chromosoom in situ hybridizatie Methode om genen en andere DNA sequenties te “mappen”  gelabelde DNA probe hybridiseren tegen gedenatureerde chromosomen in situ. Metafase of prometafase microscoop slide preparatie (zie cytogenetica), behandelen met Rnase en proteinase K  opgezuiverd chromosomaal DNA  denatureren met formamide  probe Voor of na hybridisatie chromosoom banding FISH fluorescente label direct of indirect Voor goede signaalsterkte lange probe (40kb)  noodzaak voor “blokken” van repeat sequences door supressie hybridizatie

Chromosoom in situ hybridizatie Detectie met fluorescentie microscoop Metafase spreads  dubbele hybridizatie spots (zuster chromatiden, zie cyclus) Resolutie ong. 1 Megabase

Chromosoom in situ hybridizatie

Weefsel in-situ hybridisatie In deze procedure wordt een gelabelde probe gehybridiseerd tegen RNA in weefselsecties Hybridizatie mix 50% formamide (lagere hybridisatie temp) Enkel strengige probes  complementaire RNA probes  antisense riboprobes  gen in reverse orientatie in cloning vector Radioactieve of niet-isotoop labels Fluorescentie microscopische detectie Commerciele kits verkrijgbaar vb cytomegalovirus, Epstein-Barr virus Zelfde voorzorgen en stappen als bij in-situ PCR

Immunologische technieken

Serologische technieken Eigenlijk alle technieken die gebruik maken van antilichamen  eigenlijk de meeste immunologische technieken gebruikt in diagnose Een selectie van de meest gebruikte technieken in de medische diagnostiek zal besproken worden

Bloedgroep bepaling met gel-techniek Monoclonaal antilichaam voor bloedgroep A antigen gebonden op gelmatrix Bloedgroep: A RhD neg

Latex agglutinatie Polystyreen latex micro-partikels coaten met virale of andere antigenen Mengen met serum van patient Indien Ab voor antigen zullen de partikels zichtbaar agglutineren Veel gebruikte techniek: eenvoudig en snel Vele commerciele kits: rubella, toxoplasmose, cytomegolovirus...

Latex agglutinatie

Hemaglutinatie Variant van de latex agglutinatie techniek Rode bloedcellen zijn de deeltjes Bloedgroep bepaling met antigenen reeds aanwezig op de cellen Rode bloedcellen kunnen ook gecoat worden met andere antigenen (zie THPA test voor syfillis)