Automatisatie van immunofluorescentie op paraffinecoupes en vriescoupes van nierbiopten met de Benchmark XT Door Tracy Rogiers Dienst pathologische anatomie Dr. P. De Paepe en De heer T. Pont

Inleiding Methode Resultaten Conclusie 1 glomerulaire filter Immuuncomplexen Glomerulonefritis Principe van de IF kleuring op de Benchmark XT Methode Immunofluorescentie op vriescoupes Immunofluorescentie op paraffinecoupes Resultaten Staal 07B 3915 Staal 08B 1345 Staal 08B 3740 Staal 08B 4258 Conclusie 1

Inleiding De glomerulaire filter 3 compartimenten: Subendotheliale ruimte en glomerulaire basale membraan Subepitheliale compartiment Mesangium 2

Inleiding Immuuncomplexen Met immunofluorescentie gaat men immuuncomplexen gaan opsporen die IgA, IgG, IgM, C1q, C3, kappa- en lambdaketens bevatten 3

Inleiding Glomerulonefritis Casus 4 Patiënt, 54 jr. oud gekend voor SLE heeft veel eiwitverlies in de urine en de nierfunctie gaat achteruit. Bij immunofluorescentie onderzoek van het nierbiopt zijn er overwegend mesangiale en hier en daar deposities t.h.v. de capillaire wand van IgA, IgG, C1q, C3, kappa en lambda zichtbaar. IgG is moeilijk interpreteerbaar. Alles wijst op een ‘full house’ wat verwacht wordt bij SLE. Conclusie: Lupusnefritis klasse III tot IV 4

Inleiding Principe van de IF kleuring met de Benchmark XT VENTANA Benchmark XT Directe immunofluorescentie 5

Immunofluorescentie op vriescoupes Methode Immunofluorescentie op vriescoupes Manuele FITC kleuring Dakocytomation polyklonaal FITC – gelabelde konijnen antilichamen Geautomatiseerde FITC kleuring met VENTANA Benchmark XT VENTANA polyklonaal FITC – gelabelde schapen antilichamen 6

FITC Primaire Antilichamen Methode Immunofluorescentie op vriescoupes Aangepaste incubatietijden van de verschillende VENTANA FITC –gelabelde primaire antilichamen FITC Primaire Antilichamen Incubatietijd Anti-C1q 16 minuten Anti-C3 Anti-IgA Anti-IgG 2 minuten Anti-IgM Anti-Kappa 12 minuten Anti-lambda 7

Methode Immunofluorescentie op paraffinecoupes Geautomatiseerde FITC kleuring met VENTANA Benchmark XT methode 1 Zelfde procedure als voor de geautomatiseerde IF kleuring op vriescoupes Met als verschil formolfixatie en paraffine-inbedding Geautomatiseerde FITC kleuring met VENTANA Benchmark XT methode 2 Zelfde procedure als voor de manuele IF kleuring op paraffinecoupes Met als verschil de IF kleuring gebeurt op de Benchmark XT 8

Immunofluorescentie op paraffinecoupes Methode Immunofluorescentie op paraffinecoupes Geautomatiseerde FITC kleuring met VENTANA Benchmark XT methode 3 Gebruik van een bestaand protocol voor op paraffinecoupes Met als verschil aanpassing van de incubatietijd voor het enzym en de FITC – gelabelde antilichamen 9

Resultaat : Staal 07B 3915 A. Gekend resultaat voor immunofluorescentie: IgA nefropathie. IgA Oplichtende cilinders in de tubuli IgG Negatief IgM C3 Vas afferens vertoont een granulaire oplichting C1q Kappa/Lambda Polyklonale oplichting in de tubuli B. Resultaat manuele IF kleuring op vriescoupes: IgA Granulaire neerslag 1+ IgG Niet te beoordelen IgM C3 Granulaire neerslag t.h.v. capillaire wand 1+ C1q Kappa/Lambda 10

Resultaten: Staal 07B 3915 C. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op vriescoupes met de VENTANA Benchmark XT: Niet te beoordelen D. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op paraffinecoupes met de VENTANA Benchmark XT methode 1: Niet te beoordelen Depositie van IgA 11

Resultaat: Staal 08B 1345 A. Gekend resultaat voor immunofluorescentie:Diffuse glomerulonefritis met tekens van focale sclerose. IgA Granulaire neerslag t.h.v. mesangium 2+ en capillaire wand 1+ IgG Negatief IgM Discrete mesangiale granulaire neerslag 1+ C3 Granulaire neerslag t.h.v. glomeruli en capillaire wand 2+ C1q Kappa/Lambda B. Resultaat manuele IF kleuring op vriescoupes: IgA Granulaire neerslag 1+ IgG Niet te beoordelen IgM C3 Granulaire neerslag 2+ C1q Negatief Kappa/Lambda 12

Resultaat: Staal 08B 1345 C. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op paraffinecoupes met de VENTANA Benchmark XT methode 1 en 2: Niet te beoordelen Depositie van C3 13

Resultaat: Staal 08B 3740 A. Gekend resultaat voor immunofluorescentie: lupusnefritis klasse III tot IV (A/C) IgA Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand IgG IgM C3 C1q Kappa/Lambda Polyklonale neerslag B. Resultaat manuele IF kleuring op vriescoupes: IgA Granulaire neerslag 2+ IgG Niet te beoordelen IgM C3 C1q Kappa/Lambda Polyklonale neerslag 1+ 14

Resultaat: Staal 08B 3740 C. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op paraffinecoupes met de VENTANA Benchmark XT methode 1: Niet te beoordelen Depositie van IgM 15

Resultaat: Staal 08B 4258 A. Gekend resultaat voor immunofluorescentie: Gekende SLE klasse IIIC IgA Granulaire neerslag t.h.v. mesangium en capillaire wand IgG IgM C3 C1q Kappa/Lambda Polyklonale neerslag B. Resultaat manuele IF kleuring op vriescoupes: IgA Granulaire neerslag 2+ IgG Niet te beoordelen IgM C3 C1q Kappa/Lambda Polyklonale neerslag 2+ 16

Resultaat: Staal 08B 4258 C. Resultaat geautomatiseerde IF kleuring op paraffinecoupes met de VENTANA Benchmark XT methode 1: Niet te beoordelen Depositie van C1q 17

Conclusie Naar aanleiding van de gedeeltelijke automatisatie van immunofluorescentie op paraffinecoupes en vriescoupes van nierbiopten met de Benchmark XT vertoonde de FITC kleuring op de vriescoupes het beste resultaat. Dit in tegenstelling tot de kleuring van de paraffinecoupes waarbij het weefsel volledig aankleurde of helemaal niet. Om een geautomatiseerde immunofluorescentie op paraffinecoupes uit te voeren moet er een geschikt protocol aanwezig zijn in de software van de Benchmark XT. Aanpassingen aan bestaande protocols leverde niets op. De poging om te automatiseren is dus niet compleet geslaagd. 18