Neonatale screening naar de ziekte van Duchenne OP PUNT STELLING EN VALIDATIE VAN EEN CREATINE KINASE BEPALING Thijs Decuyper O.l.v. Dr. D. Bernard en ABO E. Verhoye

Theoretisch gedeelte Praktisch gedeelte 1. Neonatale screening INHOUDSOPGAVE 1. Neonatale screening 2. De ziekte van Duchenne 3. Enzymatische creatine kinase bepaling Praktisch gedeelte 4. Op punt stellen van de methode 5. Validatie van de gekozen methode 6. Besluit en discussie

Theoretisch gedeelte 1. Neonatale screening 2. De ziekte van Duchenne 3. Enzymatische creatine kinase bepaling

Neonatale screening Opsporen aangeboren aandoeningen Voorwaarden voor neonatale screening 11 aandoeningen opgespoord Via hiel- of handrugprik

Voorwaarden de ziekte dient ernstig te zijn ; 1. Neonatale screening de ziekte dient ernstig te zijn ; niet tijdig klinisch herkend te worden; frequent in de bevolking voorkomen; betrouwbare, eenvoudige en goedkope test beschikbaar; de test moet aanvaardbaar zijn voor de patiënt en/of zijn ouders; er moeten methoden beschikbaar zijn voor de definitieve diagnose; Er moet een efficiënte behandeling die een substantiële verandering in de levenskwaliteit met zich meebrengt zijn. 5

Opgespoorde aandoeningen 1. Neonatale screening Hyperfenylalaninemie of fenylketonurie Congenitale hypothyreoïdie Congenitale bijnierschorshyperplasie (CAH of adrenogenitaal syndroom MCAD deficiëntie MMA of methylmalonacidemie Glutaaracidurie type 1 MSUD of maple syrup urine disease IVA of geïsoleerde isovaleriaanzuuracidemie Biotinidasedeficiëntie Propionzuur acidemie MADD of glutaaracidurie type II

Duchenne’s spierdystrofie (DMD) 2. De ziekte van Duchenne X-gebonden recessief overgeërfde spierziekte Gen dystrofine op Xp21 Bijna alleen bij jongens Incidentie 1/3500 – 4000 Geen dystrofine aanmaak  spierschade bij elke samentrekking (CK vrijstelling) Pseudohypertrofie  spiercellen verdwijnen  vet- en bindweefsel

Duchenne’s spierdystrofie (DMD) 2. De ziekte van Duchenne Leeftijd bij sterven: ongeveer 20 jaar Supportieve therapie is mogelijk (fysiotherapie, …) Curatieve therapie is de toekomst (exon skipping)

ATP + creatine  ADP + fosfocreatine Creatine kinase 3. Enzymatische creatine kinase bepaling CK vrij, door spiercelnecrose 20 tot 100 x verhoogd Creatine kinase katalyseert Klassieke CK bepaling via UV-spectrofotometrie en op plasma (NU: vol bloed + hemolyse) ATP + creatine  ADP + fosfocreatine

Creatine kinase 3. Enzymatische creatine kinase bepaling Enzymatische creatine kinase bepaling door middel van fluorometrie (NADPH) Het signaal van NADPH is recht evenredig met [CK] golflengten van ex.= 355 nm en em.= 460 nm Interferenties (adenylaatkinase, ...) creatine fosfaat + ADP <-CK-> creatine + ATP glucose + ATP <-HK-> glucose-6-P + ADP glucose-6-P + NADP+ <-6GP-DH-> gluconate-6-P + NADPH + H+

Praktische gedeelte 1. Op punt stellen van de methode 2. Validatie van de gekozen methode Gebruikte stalen in het praktische gedeelte zijn gespotte bloedstalen op bloedkaarten. (zelf aangemaakt of screeningskaarten van pasgeborenen).

Aflezen met fluorometer Eenstapsreactie Eenstapsmethode Plaat schudden + incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat centrifugeren + 150 µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer

Op punt stellen van de methode Verhouding reagens/ethanol volume Verschil in incubatietijden/temperaturen Centrifugeren Fluorescentie versus UV aflezing Verschil in natriumfluoride concentraties Heparine standaarden versus EDTA standaarden Blanco’s vergelijken Eenstapsreactie versus tweestapsreactie

Verhouding reagens/ethanol volume 4. Op punt stellen van de methode Geteste verhoudingen: 75/75 en 75/150 Interpretatie: ½ verhouding beter, ethanol: reactie stoppen + eiwitneerslag Plaat schudden + incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat centrifugeren + 150 µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer

Verschil in incubatietijden/temperaturen 4. Op punt stellen van de methode Geteste verschillen: 30 minuten op 30 °C 20 minuten op 35 °C Interpretatie: 30 min op 30°C is de beste optie. CK kan beter elueren, meer CK die vrijkomt. Plaat schudden + incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat centrifugeren + 150 µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer

Aflezen met fluorometer Centrifugeren 4. Op punt stellen van de methode Geteste verschillen: meten na alcoholprecipitatie, na centrifugeren en niet centrifugeren Interpretatie: Betere resultaten voor het centrifugeren. Echter, door quenching beter resultaten verwacht na centrifugeren. Mogelijke verklaring: verdamping van ethanol Plaat schudden + incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat centrifugeren + 150 µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer

Fluorescentie versus UV aflezing 4. Op punt stellen van de methode Geteste verschillen: aflezen met fluorometer en UV-spectrofotometer. Interpretatie: Het is beter om met fluorometrie te meten. Eliminatie van doorzuigstap of pipeteerstap. Plaat schudden + incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat centrifugeren + 150 µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer

Verschil in natriumfluoride concentraties 4. Op punt stellen van de methode Geteste verschillen: 25 mmol/L, 125 mmol/L en 250 mmol/L. Interpretatie: Het is beter om met 250 mmol/L NaF te werken voor de betere inhibitie van adenylaatkinase. Plaat schudden + incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat centrifugeren + 150 µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer

Heparine standaarden versus EDTA standaarden 4. Op punt stellen van de methode Geteste verschillen: Heparine standaarden en EDTA standaarden. Interpretatie Het is beter om met EDTA gewassen standaarden te werken. CK oplossing niet goed verspreid ondanks het vele mengen. Plaat schudden + incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat centrifugeren + 150 µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer

Aflezen met fluorometer Blanco’s vergelijken 4. Op punt stellen van de methode Geteste verschillen: EDTA gespotte blanco’s en ongespotte blanco’s . Interpretatie: Het is beter om met de ongespotte blanco’s te werken aangezien deze onmogelijk CK bevatten. Plaat schudden + incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) Plaat centrifugeren + 150 µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer

Eenstapreactie versus tweestapsreactie Eenstapsmethode Plaat schudden + incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 75 µL reagens (R1 + R2 + NaF) + 150 µL EtOH Plaat schudden 15 min laten staan Aflezen met fluorometer

Eenstapreactie versus tweestapsreactie Geteste verschillen: Eenstapsreactie en tweestapsreactie. Interpretatie: Het is beter om met de tweestapsreactie te werken. Beter elueren + reactivatie in pre-incubatiestap. Plaat schudden + pre-incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 50 µL reagens A (R1 + NaF) Aflezen met fluorometer 15 min laten staan Millipore plaatafzuigsysteem Plaat schudden + 150 µL EtOH Incubatie zonder schudden + werkreagens B (75 µL R2)

Besluit Betere resultaten met: ½ reagens/ethanol verhouding 4. Op punt stellen van de methode Betere resultaten met: ½ reagens/ethanol verhouding 30 minuten op 30°C zonder centrifugeren Fluorescentie aflezing 250 mmol/L NaF EDTA standaarden Ongespotte blanco’s Tweestapsreactie

Tweestapsreactie Tweestapsreactie Plaat schudden + pre-incubatie PUNCHEN bloedkaarten + 50 µL reagens A (R1 + NaF) Aflezen met fluorometer 15 min laten staan Millipore plaatafzuigsysteem Plaat schudden + 150 µL EtOH Incubatie zonder schudden + werkreagens B (75 µL R2)

Validatie van de methode 5. Validatie van de gekozen methode Intra-run Between-run Juistheid Eigen referentiewaarden Reproduceerbaarheid externe controles Meetbereik Lineariteit Stabiliteit

Intra-run Werkwijze 1 staal 21 x meten in 1 run concentratie counts 5. Validatie van de gekozen methode Werkwijze 1 staal 21 x meten in 1 run concentratie counts Gemiddelde 325 2503 SD 31 112 CV% 9 4 Interpretatie: CV% onder 10 %.

Between-run Werkwijze 1 staal over 21 runs 1 x meten in elke run 5. Validatie van de gekozen methode Werkwijze 1 staal over 21 runs 1 x meten in elke run concentratie counts Gemiddelde 490 4000 SD 44 390 CV% 9 9 Interpretatie: CV% onder 10 %.

Juistheid Werkwijze CDC waarde vergelijken met de zelf gemeten waarde 5. Validatie van de gekozen methode Werkwijze CDC waarde vergelijken met de zelf gemeten waarde Interpretatie: Correlatie moet 1 benaderen (0,991). Positieve bias door zelf gemaakte standaarden => geen kwantitatief meting mogelijk. Geen externe standaarden internationaal beschikbaar.

Eigen referentiewaarden 5. Validatie van de gekozen methode Werkwijze 698 stalen screenen en uitzetten in histogram Aantal gescreend: 698 Gemiddelde counts: 2231 SD: 356 99ste percentieel: 3179 Interpretatie: 99ste percentieel: 3179 counts Gemiddelde + 3 SD: 4722 counts

Reproduceerbaarheid van externe controles 5. Validatie van de gekozen methode Werkwijze Vergelijken van CDC controles over 21 verschillende runs CV% Base 9 Low 7 Intermediate 9 High 9 Interpretatie: CDC controles liggen onder CV% onder 10 %.

Meetbereik (bovengrens) 5. Validatie van de gekozen methode Werkwijze Reeks aanmaken met zeer hoge CK-concentraties, [CK] uitzetten op aantal counts Interpretatie: bovengrens ligt ongeveer op 8000 counts

Lineariteit Werkwijze 5. Validatie van de gekozen methode Werkwijze Gemeten concentraties CK uitzetten tov. aantal counts Interpretatie: Rechtlijnig verband tussen counts en concentratie CK in plasma.

Stabiliteit Rechtlijnig verband tussen counts en concentratie CK. 5. Validatie van de gekozen methode Werkwijze Staal over 3 dagen gemeten en opgeslagen in verschillende temperaturen CV% Oven 4 Kamertemp. 2 Koelkast 12 Diepvries 3 Interpretatie: CV % ligt bij de meeste onder 10 %. Beperkte tijdspanne -> goede resultaten. Rechtlijnig verband tussen counts en concentratie CK.

Besluit en discussie 6. Besluit Neonatale screening naar de ziekte van Duchenne is pas te overwegen als een curatieve therapie bestaat. Beste performantie met tweestapsreactie en fluorometrische aflezing. Discussiepunten: - niet kwantitatief (pos. bias tov. CDC controles) (ideaal beschikbare externe standaarden) - verder op punt stelling van methode voor aanmaak standaarden (geen theoretische [CK], maar gemeten [CK] in plasma van standaard).

Bedankt voor jullie aandacht! HOWEST.be Thijs Decuyper Stageplaats: AZ Sint-Jan Brugge AV Dienst: Klinische scheikunde, afdeling neonatale screening Stagementor: Dr. D. Bernard ABO E. Verhoye Eindwerktitel: Op punt stelling van een enzymatische CK bepaling voor de neonatale screening naar de ziekte van Duchenne Bedankt voor jullie aandacht! Vragen?