basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie door Peter Roels Monitoraat Wetenschappen K.U. Leuven Deel 2

DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning polymerase-kettingreactie DNA-sequentiebepaling basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

polymerase-kettingreactie DNA-dubbelhelix RENATURATIESTAP 40-60°C enkelstrengs DNA + primer 5’...ATTCGCTCGCAATATAGATCTC 3’ 3’ GCGTTATATCTCGAG 5’ DENATURATIESTAP 92°C enkelstrengs DNA

polymerase-kettingreactie DNA-dubbelhelix RENATURATIESTAP 40-60°C enkelstrengs DNA + primer DENATURATIESTAP 92°C enkelstrengs DNA POLYMERISATIESTAP 72°C bijna voltooide DNA- dubbelhelices

polymerase-kettingreactie 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ nieuwe streng

polymerase-kettingreactie 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ nieuwe streng

polymerase-kettingreactie

cyclusgewenste fragmententotaal aantal ds% gewenst/totaal … > 99, >>99,9

polymerase-kettingreactie: meer over primers… 5’ … GCGGTGCAAG … 3’ 3’ CACGT 5’ 45°C specifiek 3’ CACGT 5’ 5’ … GCGGTGCAAG … 3’ 40°C aspecifiek 5’ … GCGGTGCAAG … 3’ 3’ CACGT 5’ 50°C geen binding temperatuur

polymerase-kettingreactie: meer over primers… geen polymerisatie 5’ … GCGATGCAAG … 3’ 3’ CACGT 5’ niet complementair aan 3’-einde primer polymerisatie 5’ … GCGGTGCGAG … 3’ 3’ CACGT 5’ niet complementair aan 5’-einde primer polymerisatie 5’ … GCGGTGCAAG … 3’ 3’ CACGT 5’ complementair

PCR versus celkloning PCRCelkloning snel, makkelijkomslachtig in principe vanaf 1 celvoldoende uitgangsmateriaal nodig

PCR versus celkloning PCRCelkloning snel, makkelijkomslachtig in principe vanaf 1 celvoldoende uitgangsmateriaal nodig kennis sequentie flankerende gebieden nodig geen a priori kennis sequentie nodig relatief korte fragmentenlange fragmenten

DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning polymerase-kettingreactie DNA-sequentiebepaling basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

DNA-sequentiebepaling: reacties 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ stop A stop C stop G stop T

stop A DNA-sequentiebepaling: reacties stop A 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ + polymerase nucleotiden (A, C, G, T*) primer (5’ ACCG 3’) stopnucleotide A

stop A 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCG 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCG 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCG 3’ TGA TGACGA TGACGAT

stop A 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCG 3’ TGA TGACGA TGACGAT

stop A DNA-sequentiebepaling: reacties

stop A stop C stop G stop T DNA-sequentiebepaling: elektroforese - + stop A stop C stop G stop T

DNA-sequentiebepaling: interpretatie stop A stop C stop G stop T 5’ ACCGT

DNA-sequentiebepaling: interpretatie stop A stop C stop G stop T 5’ ACCGTG

DNA-sequentiebepaling: interpretatie stop A stop C stop G stop T 5’ ACCGTGA

DNA-sequentiebepaling: interpretatie stop A stop C stop G stop T 5’ ACCGTGAC

DNA-sequentiebepaling: interpretatie stop A stop C stop G stop T 5’ ACCGTGACG

DNA-sequentiebepaling: interpretatie stop A stop C stop G stop T 5’ ACCGTGACGA

DNA-sequentiebepaling: interpretatie stop A stop C stop G stop T 5’ ACCGTGACGA? 3’

DNA-sequentiebepaling: interpretatie stop A stop C stop G stop T 5’ ACCGTGACGA? 3’ 3’ TGGCACTGCT? 5’

DNA-sequentiebepaling: cycle sequencing simulatie

DNA-sequentiebepaling: cycle sequencing