Plaatsgerichte mutagenese Primrose & Twyman Principles of Gene Manipulation and Genomics, 7e editie (2006), Hoofdstuk 8 - doel: enkelvoudige of enkele posities gericht wijzigen in een DNA fragment (kloon) (enkelvoudige, gerichte wijzigingen in een genoom vergen bijzondere technieken, kunnen ondermeer via in vivo recombinatietechnieken ; worden hier niet behandeld) - 'reverse genetics' : klassieke genetica : willekeurig mutaties invoeren om fenotype te creëren => plaats van mutatie zoeken (en karteren) 'reverse' genetica : mutatie invoeren op welbepaalde plaats => mogelijk effect op fenotype (functie) bekijken - drie basisbenaderingen: (1) cassettemutagenese (2) primerverlenging (3) PCR

(klassieke) genetica causaliteit DNA fenotype ‘reverse genetics’

Relatie tussen mutagenese-efficiëntie en het aantal kloons, nodig om de aanwezigheid van de gewenste mutant te verzekeren, met 90% probabiliteit * Het aantal geanalyseerde kloons moet voldoende hoog zijn om met behoorlijke kans de gewenste mutant te vinden (afhankelijk van de probabiliteit van voorkomen van de mutatie, hetgeen afhankelijk is van de gebruikte procedure (of techniek)).

Cassettemutagenese - excisie van een DNA fragment (restrictieknipplaatsen !) + vervanging door een chemisch-gesynthetiseerd fragment (2 of meer oligonucleotiden) - VOOR - hoge efficiëntie - multipele uitwisseling mogelijk, inclusief degeneraties - TEGEN - vereist flankerende "unieke" knipplaatsen - synthesecapaciteit moet voldoende hoog zijn - gebruik overlappende sets oligonucleotiden mogelijk (cfr. chemische synthese) - bij complexe degeneraties : 2de streng aanmaken door fill-in (vanaf 3’ uiteinde) - gebruik van inosine mogelijk om mismatches tussen de strengen te vermijden - ook deleties en grote inserties zijn mogelijk

mismatch posities Uitwisseling van restrictiefragmenten

gebruik van inosine op gerandomiseerde posities (N hoeft niet per se 25% van elk te zijn, maar kan ook bvb. 97% van het oorspronkelijke nucleotide en 1% van elk van de 3 andere) nb. alleen Met en Trp vereisen een G op de derde positie van het triplet, voor de andere 18 volstaat een C of G (m.a.w. hun derde letter is Y of R, voor Ile is dit H). => NNS vertegenwoordigt dus de 20 mogelijke aminozuren (inclusief het oorspronkelijke) Vooral de beperking door de noodzakelijke unieke (of bijna-unieke) restrictieknipplaatsen, maakte dat gezocht werd naar methoden met mismatch-primer-afhankelijke invulreacties, en later op basis PCR.

Mismatch primerverlenging ('primer extension') => oligonucleotide-gestuurd, mismatch-afhankelijk - vereist enkelstreng matrijs (eventueel partiëel enkelstrengig) - M13- of fasmide kloon - aanmaak van gapped-duplex - vereist mismatch oligonucleotide (chemische synthese) - belang van positie van mismatch in oligonucleotide op matrijs - 3'-effect (repair) => keuze polymerase ! - 5'-effect (displacement) => keuze polymerase ! - mogelijkheden: puntmutatie, multipele puntmutaties, insertie, deletie (ook 'sticky feet‘ mutagenese genoemd) - efficiëntie is (zeer) laag tenzij bijzondere maatregelen genomen worden waarom ? => afhankelijk van diverse factoren - transformatie door heteroduplex EN de oorspronkelijke matrijs (ss) => de oorspronkelijke (ss) matrijs geeft alleen niet-mutante transformanten - herstelmechanismen in E.coli (GATC !) => gebruik van mutL, mutS, mutH stammen

Mutagenese door mismatch primer verlenging op een enkelstrengige matrijs T C * 5’ 3’

Enkelvoudige of meervoudige puntmutaties, insertiemutations en deletiemutaties zijn mogelijk. Hoofdbekommernis is de efficiëntie van screening.

Theoretisch concept, geeft 50% wild-type en 50 mutante nakomelingen. A repair enzyme, MutS, binds to mismatches in DNA and recruits MutL, which subsequently activates the endonuclease MutH. MutH binds hemimethylated GATC sites (which can be up to 1 kb from the mismatch) and when activated will selectively cleave the unmethylated daughter strand, allowing a specific helicase and exonucleases to excise the nascent strand in the region surrounding the mismatch. The strand is then re-synthesized by DNA polymerase III. Theoretisch concept, geeft 50% wild-type en 50 mutante nakomelingen. maar : ook de enkelstrengige moleculen transformeren de waardcel, zodat meer wild-type dan mutante kloons worden gevormd ; bovendien : herstelmechanismen favoriseren de originele sequentie.

Selectie van de mutante streng : belangrijkste voorbeelden (vaak ook gemodificeerde oligonucleotiden of modificaties in de mismatch primer mogelijk, bvb. met inosine) - methode van Eckstein : - in vitro fixering van de mutatie - gebruik van fosforothioaat nucleotiden (aS-dCTP) - kenmerken van restrictieënzymen tegenover de S-modificatie - methode van Kunkel : - in vivo selectie van de mutant - "doping“ van de matrijsstreng met uridylaat : 1 à 2 % U waar T thuishoort - dubbelmutant : dut (voor dUTPase) ung (voor uracil-N-glycosidase) - transformatie van de mismatch dubbelstreng naar een wt E.coli

Methode van Eckstein Introduceer een S-gemodificeerde streng Sommige restrictieënzymen worden geïnhibiteerd door S-modificatie, maar splitsen wel nog de niet-gemodificeerde streng (=> nicking) : bvb. NciI Exonuclease III verwijdert de mismatch, maar alleen uit de parentale streng vereist : - vervanging van een dXMP door zijn zwavel-analoog op alle plaatsen - volledige kopiëring, en ringsluiting door ligase

Structuur van dCTPaS : het Sp isomeer wordt specifiek gebruikt door E. coli DNA polymerase I

methode van Kunkel voor plaatsgerichte mutagenese De biochemie achter de methode van Kunkel voor plaatsgerichte mutagenese Metabolisme van dUTP in E. coli Pijlen geven de richting aan van de omzettingen in de algemene pathway eerder dan het evenwicht bij de individuele reacties. Pijlen in vetjes duiden de majeure pathway aan. In de kadertjes staan de namen van de betrokken genen : ung : uracil-DNA N-glycosylase dut : dUTPase dcd : dCTP deaminase cdd : (deoxy)cytidine deaminase deoA : thymidine phosphorylase (deoxyuridine) 20-30 dU’s in M13mp2 DNA bij isolatie uit een dut ung E.coli stam. dCyd : deoxycytidine ; dUrd : deoxyuridine ; dThd : deoxythymidine dRib-1-P : deoxyribose-1-fosfaat

Vergelijking tussen strategie van Eckstein en van Kunkel. Kunkel : => de matrijsstreng wordt gemodificeerd ; => via "manipulaties" in vivo Eckstein : => de nieuwe streng wordt gemodificeerd; => manipulaties in vitro nb. Kunkel methode : Diverse variaties werden getest, met al dan niet toevoeging van een in vitro ligatiestap, met al dan niet een uracil glycosylasestap, en deze al dan niet gevolgd door reactie in alkali. Het beste resultaat, qua aantal kloons en aantal mutanten werd echter bekomen, met alleen de ligatiestap na mismatch-primer extensie. (En dus herstelreacties voornamelijk in vivo.)

Hybridisatie van twee lineaire DNA fragmenten, of één circulair DNA (de vector) met een complementaire streng die er deels mee overlapt (= vorming van de gap) ; tussen beide is een extra selecteerbare mismatch aanwezig, waardoor selectie van de mutant mogelijk is. Ook mogelijk met 2 (of 3) mismatch primers op een circulaire vector. Telkens hierbij is behoud van “koppeling” tussen de segmenten is noodzakelijk. - gapped duplex methode, met extra (= begeleidende) mismatch tgo de complementaire streng - transformatie naar een niet-suppressor stam (Su-) - expressie vanaf de parentale streng vereist een amber suppressor - gapped duplex method, met alternerende (= omwisselbare) ambermutaties : - Apam => ApR en CmR => Cmam, en vice versa - steeds transformatie naar een Su- stam - maakt consecutieve mutageneses makkelijker - in vivo selectie met een wijziging in de selectiemerker - toevoeging van een selectieprimer die het bla gen wijzigt - het mutante bla gen geeft resistentie tegen ceftazidime + ampicilline - niet-mutante transformanten overleven niet op ceftazidime - T4 polymerase vult de openingen (gaps) nauwkeurig in (geen 5'-3' exo, geen ‘strand displacement’) - er is een goede koppeling tussen de mismatchen m.a.w. geen cross-over : aanwezigheid van beide gaat samen

In vitro mutagenese met de ‘gapped duplex’ methode en fenotypische selectie door amber-suppressie Omwisseling van waardcel tussen “amber-suppressing” en “non-suppressing” fenotype. Selectie door gebruik van de niet-suppresserende waardcel.

“Gapped duplex” methode met fenotypische selectie Omwisseling tussen twee resistentiegenen, rekening houdend met de suppressie-fenotypes. Volle balk : wild-type gen Open balk : ambermutant Amps en Cms staan voor Ampam en Cmam Gebruik van kloons in fasmidevectoren voor aanmaak van de enkelstrengige matrijsstreng.

Met gebruik van 2 mismatch oligonucleotiden Selectie van mutanten door een extra mutatie in een bla gen zodat ceftazidime resistentie ontstaat. De "begeleidende" mutatie wijzigt het bla gen mutante TEM bla S K G 5´ p AAA TCT GGA GCC TCC AAG GGT GGG TCT CGC 3´ aaa tct gga gcc GGT GAG Cgt ggg tct cgc wild-type TEM bla G E R Ceftazidime Ter illustratie

PCR-gebaseerde plaats-specifieke mutagenese - uitschakeling van de parentale matrijs door amplificatie - mismatch primer op de doelwitpositie => bij “terugpriming” (in 2de cyclus) wordt de wijziging gefixeerd - uitbreiding van cassettemutagenese, maar de regio’s (fragmenten) kunnen veel groter zijn ; restrictieplaats "in de omgeving" van de mismatch is nodig, maar dat mag niettemin op een redelijke afstand zijn (bvb. 25 of zelfs meer nucleotiden, zolang de primer synthetiseerbaar blijft) - de nood aan restrictieplaats kan omzeild worden door een werkwijze die sterk op SOE lijkt - 'megaprimer' mutagenese: tweestapsprocedure, waarin het vroege ampliconproduct de primer wordt in de daaropvolgende amplificatie - door inverse PCR : indien de vector klein genoeg is - lineair product - circularisatie nodig - een splitsingsplaats is weerom zeer nuttig - primers met staarten maken substantiële inserties mogelijk - “universele” methode met Class-II restrictieplaatsen en enzymen

De megaprimer methode De mutante moleculen gevormd in de eerste PCR-rondes fungeren als primers in de latere cycli van de PCR.

Aanpassingen van “inverse PCR” : ook langere inserties kunnen gecrëëerd worden Linearisering bij : na amplificatie opnieuw splitsing aan de uiteinden en ligatie. => vereist dus een knipplaats “in de buurt” (en uniek in de vector)

Gebruik van EarI of andere ClassII-S enzymen ligase PCR Gebruik van EarI of andere ClassII-S enzymen EarI : afsplitsing van extra "staarten" C T C T T C (1 / 4) herkenningssequentie van EarI ----CTCTTCn ----GAGAAGnnnn

Andere alternatieven : - ExsiteTM methode : tegenselectie met DpnI - GeneTailorTM methode : in vitro C-methylatie en in vivo afbraak van parentale streng De PCR methoden zijn een majeure benadering geworden voor gerichte mutagenese - VOOR - efficientie zo goed als 100% (onder optimale condities) - eenvoud - TEGEN - het product is lineair: inbouw in een vector of circularisatie is nodig om het amplicon te kloneren - risico van extra mutaties (in de rest van het amplicon) => sequencing van het ganse amplicon nodig => keuze van polymerase is belangrijk ... veel andere alternatieven, met ondermeer meervoudige gerichte mutaties op een welbepaalde plaats in een coderende sequentie, insertie van ongewone aminozuren, gene shuffling, enz.

'ExsiteTM' -methode Plasmide DNA uit een dam+ stam Inverse PCR met 5'-gefosforyleerde primers (T4-kinase + ATP) Behandeling met DpnI vernietigt de parentale strengen (GmeATC) (inclusief de hemi-gemethyleerde) Circularisatie met ligase en transformatie van E. coli

'GeneTailor' -methode In vitro methylatie van het plasmide DNA (meC) Amplificatie via inverse PCR met overlappende 5'-uiteinden (+ één mismatch primer) Transformatie van een E. coli wt-stam (mcrBC+) McrBC endonuclease vernietigt de gemethyleerde matrijsstreng De 'repair'-enzymen circulariseren het linaire product. E. coli McrBC is een restrictieënzym dat splitst bij C-gemethyleerde RC sequenties. CpG methylase kan in deze techniek gebruikt worden voor methylering (M.SssI) aangezien een deel van deze sequenties wel zal voorafgegaan worden door een purine-nucleotide.

* Detectie (bevestiging) van mutanten - fysisch: ontstaan of verdwijnen van een knipplaats (restrictieanalyse) (reverse-translation analyse naar mogelijke manipulatie) - sequencing: extra primer nodig op korte afstand van de mismatch positie - hybridisatie: +/- analyse met de mismatch-primer any aa Codewoord tabel voor ‘reverse translation’ Leu = 1T2 Arg = 3G4 Ser = 567 met 1,2,3,4,5,6,7 als conditionele codes waarbij een extra relatie tussen de tripletposities is (1 versus 3, of 1 versus 2 en 3) *

* Creëren of verwijderen van een restrictieknipplaats als hulp bij screening naar plaatsspecifieke mutanten * Doel : vervangen Trp door Phe Hulp bij screening : MnlI splitsing Mismatch primer : …GCCCTGGGCTTCGGTGGCA…