Basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie door Peter Roels Monitoraat Wetenschappen K.U. Leuven Deel 2.

Presentatie over: "Basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie door Peter Roels Monitoraat Wetenschappen K.U. Leuven Deel 2."— Transcript van de presentatie:

1 basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie door Peter Roels Monitoraat Wetenschappen K.U. Leuven Deel 2

2 DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning polymerase-kettingreactie DNA-sequentiebepaling basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

3 polymerase-kettingreactie DNA-dubbelhelix RENATURATIESTAP 40-60°C enkelstrengs DNA + primer 5’...ATTCGCTCGCAATATAGATCTC 3’ 3’ GCGTTATATCTCGAG 5’ DENATURATIESTAP 92°C enkelstrengs DNA

4 polymerase-kettingreactie DNA-dubbelhelix RENATURATIESTAP 40-60°C enkelstrengs DNA + primer DENATURATIESTAP 92°C enkelstrengs DNA POLYMERISATIESTAP 72°C bijna voltooide DNA- dubbelhelices

5 polymerase-kettingreactie 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ nieuwe streng

6 polymerase-kettingreactie 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ nieuwe streng

7 polymerase-kettingreactie

8

9

10

11 cyclusgewenste fragmententotaal aantal ds% gewenst/totaal 1020 2040 32825 481650 … 201.048.5361.048.576> 99,9 301.073.741.7641.073.741.824>>99,9

12 polymerase-kettingreactie: meer over primers… 5’ … GCGGTGCAAG … 3’ 3’ CACGT 5’ 45°C specifiek 3’ CACGT 5’ 5’ … GCGGTGCAAG … 3’ 40°C aspecifiek 5’ … GCGGTGCAAG … 3’ 3’ CACGT 5’ 50°C geen binding temperatuur

13 polymerase-kettingreactie: meer over primers… geen polymerisatie 5’ … GCGATGCAAG … 3’ 3’ CACGT 5’ niet complementair aan 3’-einde primer polymerisatie 5’ … GCGGTGCGAG … 3’ 3’ CACGT 5’ niet complementair aan 5’-einde primer polymerisatie 5’ … GCGGTGCAAG … 3’ 3’ CACGT 5’ complementair

14 PCR versus celkloning PCRCelkloning snel, makkelijkomslachtig in principe vanaf 1 celvoldoende uitgangsmateriaal nodig

15 PCR versus celkloning PCRCelkloning snel, makkelijkomslachtig in principe vanaf 1 celvoldoende uitgangsmateriaal nodig kennis sequentie flankerende gebieden nodig geen a priori kennis sequentie nodig relatief korte fragmentenlange fragmenten

16 DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning polymerase-kettingreactie DNA-sequentiebepaling basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

17 DNA-sequentiebepaling: reacties 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ stop A stop C stop G stop T

18 stop A DNA-sequentiebepaling: reacties stop A 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ + polymerase nucleotiden (A, C, G, T*) primer (5’ ACCG 3’) stopnucleotide A

19 stop A 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCG 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCG 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCG 3’ TGA TGACGA TGACGAT

20 stop A 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCGTGACGAT 3’ 3’ TGGCACTGCTA 5’ 5’ ACCG 3’ TGA TGACGA TGACGAT

21 stop A DNA-sequentiebepaling: reacties

22 stop A stop C stop G stop T DNA-sequentiebepaling: elektroforese - + stop A stop C stop G stop T

23 DNA-sequentiebepaling: interpretatie stop A stop C stop G stop T 5’ ACCGT

24 DNA-sequentiebepaling: interpretatie stop A stop C stop G stop T 5’ ACCGTG

25 DNA-sequentiebepaling: interpretatie stop A stop C stop G stop T 5’ ACCGTGA

26 DNA-sequentiebepaling: interpretatie stop A stop C stop G stop T 5’ ACCGTGAC

27 DNA-sequentiebepaling: interpretatie stop A stop C stop G stop T 5’ ACCGTGACG

28 DNA-sequentiebepaling: interpretatie stop A stop C stop G stop T 5’ ACCGTGACGA

29 DNA-sequentiebepaling: interpretatie stop A stop C stop G stop T 5’ ACCGTGACGA? 3’

30 DNA-sequentiebepaling: interpretatie stop A stop C stop G stop T 5’ ACCGTGACGA? 3’ 3’ TGGCACTGCT? 5’

31 DNA-sequentiebepaling: cycle sequencing simulatie http://www.dnalc.org/resources/BiologyAnimationLibrary.htm

32 DNA-sequentiebepaling: cycle sequencing