Eiwitonderzoek bij ziekten Jolein Gloerich

VWO Bernardinuscollege Heerlen Natuur & Techniek profiel

Scheikunde Universiteit Utrecht Afstudeerrichting Biochemie Waarom? Uitdagende studie Chemische processen in het lichaam

Universiteit van Amsterdam Academisch Medisch Centrum Promotie onderzoek 4 jaar Laboratorium Erfelijke Stofwisselingziekten Eiwitonderzoek

Radboud Universiteit Nijmegen Universitair Medisch Centrum Wetenschappelijk onderzoek Laboratorium Kindergeneeskunde & Neurologie Erfelijke stofwisselingsziekten Nijmegen Proteomics Facility

Kijken naar alle eiwitten Identificatie van eiwitten Overzicht Inleiding Eiwitten en ziekte Kijken naar alle eiwitten 2 technieken om eiwitten te scheiden Identificatie van eiwitten Massaspectrometer Wat hebben we hieraan???

Onderzoek naar ziektes: eiwitten!!! Inleiding Eiwitten A B Onderzoek naar ziektes: eiwitten!!!

Inleiding Eiwitsynthese DNA RNA Eiwit

Inleiding Eiwitsynthese DNA RNA Eiwit

Inleiding Eiwitsynthese DNA RNA Eiwit

Inleiding Eiwitten Aminozuren Verschillende eigenschappen Basisch/zuur Hydrofiel/hydrofoob Lading

Aantal aminozuren/massa Inleiding Eiwitten Aminozuren Verschillende eigenschappen Volgorde aminozuren Aantal aminozuren/massa

Inleiding Erfelijke ziekte

Eiwit met fout aminozuur: Inleiding Fout in DNA: Eiwit met fout aminozuur: Geen invloed op functie Eiwit werkt niet meer Geen eiwit aanwezig

Inleiding Erfelijke ziekte A B

Inleiding Erfelijke ziekte A B

Inleiding A B C

Inleiding Regulatie A B C

Inleiding Alle eiwitten in een weefsel → proteoom Kijken naar alle eiwitten → proteomics Hoeveel eiwitten zijn er ???? In totaal: ± 2.000.000 eiwitten In een weefsel: ± 4.000-5.000

Inleiding Cel: alle genen aanwezig, maar niet alle eiwitten! Soorten eiwitten afhankelijk van functie:

Inleiding Onderzoek naar ziekte Gezonde persoon Patiënt

Inleiding Onderzoek naar ziekte Kijken naar verschillen in eiwitten: Aanwezig/afwezig Verschil in concentratie

Inleiding Probleem: 4000 verschillende eiwitten in weefsel Hoe kunnen we afzonderlijke eiwitten bekijken? Scheiden van elkaar

Scheiding van eiwitten op lading De lading van een aminozuur in oplossing is afhankelijk van de pH Het iso-elektrisch punt is de pH waarbij de netto lading van een aminozuur 0 is, dus evenveel postieve als negatieve ladingen

Scheiding van eiwitten op lading Een eiwit heeft ook een iso-elektrisch punt, dus een pH waarbij de netto lading 0 is. pH=3 pH=7 pH=9 - + - + - + Lading: +3 -2

Scheiding van eiwitten op lading Netto lading Iso-elektrisck punt 3 2 1 pH 3 4 5 6 7 8 9 10 11 -1 -2 -3

Scheiding van eiwitten op lading Iso-Elektrische Focusing (IEF) pH 3 4 5 6 7 8 9 Mengsel van eiwitten Elektrisch veld aanbrengen - + Scheiding op lading gelukt !!!

Scheiding van eiwitten op massa zeef Gel van polyacrylamide Deze scheiding duurt heel lang….

Scheiding van eiwitten op massa …. Hoe kunnen we het sneller maken? Alle eiwitten een negatieve lading geven met SDS…. …. een elektrisch veld ‘trekt’ (negatieve) eiwitten sneller door de gel Gel-elektroforese

Scheiding van eiwitten op massa Gel-electroforese - + Moleculair gewicht (Mw)

Scheiding van eiwitten op massa Gel-electroforese - + Moleculair gewicht (Mw)

Scheiding van eiwitten op massa Gel-electroforese 15 20 35 45 60 75 95 110 Moleculair gewicht (Mw)

Scheiding van eiwitten Lading EN massa IEF Iso elektrisch punt 3 4 5 6 7 8 9 - +

Scheiding van eiwitten Lading EN massa IEF Iso elektrisch punt 3 4 5 6 7 8 9 - + Moleculair gewicht SDS gel-elektroforese

Scheiding van eiwitten Lading EN massa IEF Iso elektrisch punt 3 4 5 6 7 8 9 - + Moleculair gewicht SDS gel-elektroforese

Scheiding van eiwitten 2-D (lading en massa) Na kleuring van eiwitten: Kaart van bijna alle eiwitten in een weefsel veel eiwit weinig eiwit felle stip vage stip

Vergelijking gezond-ziek 2-D scheiding van eiwitten uit weefsel van patient en controle Nooit helemaal hetzelfde…

Vergelijking gezond-ziek … daarom: tegelijkertijd patient en controle bekijken Mixen van eiwitten patient en controle Alles op één hoop Geen verschil meer te zien +

Vergelijking gezond-ziek Label alle eiwitten ROOD fluorescent Patient eiwitten Controle Mix Label alle eiwitten GROEN fluorescent Alle eiwitten krijgen een kleurlabel Patient: ROOD Gezond: GROEN

Vergelijking gezond-ziek Groene en rode eiwitten mixen en in 1x scheiden met 2-D scheiding =ROOD =GROEN veel eiwit weinig eiwit felle stip vage stip

Vergelijking gezond-ziek Mix van groen en rood: [eiwit]=[eiwit]: gele stip [eiwit]>[eiwit]: groene stip [eiwit]<[eiwit]: rode stip =ROOD =GROEN

Vergelijking gezond-ziek Vooral groene en rode stippen zijn verschillend in patient en controle Welke eiwitten zijn dit?? =ROOD =GROEN

Identificatie van interessante eiwitten Stipje uit de gel snijden: Elke stip is 1 eiwit Maar welk eiwit is dit?? =ROOD =GROEN

Vergelijking gezond-ziek Eiwit isoleren IEF Gel elektroforese Eiwit Uit gel snijden `` Interessant eiwit Eiwit zit nog in gel Voor identificatie: eiwit uit gel halen Hoe??

Eiwit identificatie Eiwit in gel Trypsine: enzym betrokken bij Digestie met trypsine Trypsine: enzym betrokken bij eiwitafbraak. Knipt na elke Arg en Lys Peptiden Uit gel door diffusie

Eiwit identificatie Massaspectrometrie Combinatie van peptiden Uniek voor een eiwit Ook de combinatie van massa’s is uniek voor dit eiwit! Massa’s kun je meten met een massaspectrometer

Identificatie van een eiwit tryptic digestion Gel Protein Database ? 1 2 3 compare: “?” is identical to “2” mass spectrometry stored data or “theoretical” peptides

Massaspectrometrie van peptiden Massaspectrometer: Weegschaal voor ionen Massa/lading (m/z) Dus: peptiden ioniseren!!!

Massaspectrometrie Ionisatie van peptiden Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI)

Massaspectrometrie Ionisatie van peptiden MALDI plaat Opbrengen van peptiden/matrix mix

Massaspectrometrie Massaspectrometer (MS) Laser + Detector TOF-MS Molecular weight Intensity Time of Flight (ToF) MS Lichte ionen Vliegen sneller Dan zware ionen

Massaspectrometrie Massaspectrometer (MS)

Vergelijking gezond-ziek IEF Gel elektroforese Eiwit Uit gel snijden `` Interessant eiwit ToF MS Identificatie Eiwit !!!

Vergelijking gezond-ziek Welke eiwitten verschillen? We weten welke eiwitten in concentratie verschillen… … Wat kunnen we daarmee???? Test maken voor diagnose van ziekte

Vergelijking gezond-ziek Welke eiwitten verschillen? We weten welke eiwitten in concentratie verschillen… … Wat kunnen we daarmee???? Leren wat er precies gebeurt In een weefsel bij een ziekte Welke eiwitten spelen een rol? Belangrijk voor ontwikkeling medicijnen

http://www.proteomicsnijmegen.nl/ Laboratorium Kindergeneeskunde en Neurologie Proteomics unit: Dr. Bert van den Heuvel Dr. Jolein Gloerich Ing. Maurice van Dael Ing. Lambert Lambooy Ing. Hans Wessels