PCR basistechnieken in vitro enzymatische amplificatie van DNA - van Kleppe & Khorana tot Kary Mullis => van ‘repair’ synthese tot exponentiële amplificatie met synthetische oligonucleotiden - basisconcept van amplificatie : “when product becomes substrate” de PCR cyclus : denaturatie, primeropstap, elongatie : (2n - 2n) amplicon moleculen

- van Kleppe & Khorana (e. a - van Kleppe & Khorana (e.a.)(1971) tot Kary Mullis (Cetus Corporation)(jaren 1980) => van ‘repair synthesis’ tot exponentiële amplificatie’ met synthetische oligonucleotiden - basisconcept van amplificatie: “when product becomes substrate” de PCR cyclus: denaturatie, annealing, elongatie: (2n - 2n) amplicon moleculen - “ontstaan” (eerder dan bedacht) uit onderzoek naar erfelijke diagnostiek met synthetische oligonucleotiden i.p.v. restrictie-analyse en/of Southern hybridisatie - initiële stappen en diagnostiek : Klenow polymerase - eigenschappen van Taq polymerase: enkelvoudige polypeptide keten van 94 kDa; 200,000 E/mg Topt = 70 - 80 °C - Kcat : tot 150 nt per seconde per enzym molecule (bij 55°C nog ongeveer 24 nt/s) geen 3' => 5' exo activiteit, maar wel 5' => 3' exo activiteit (=> misincorporatie frequentie 10-5 tot 2x10-4 per nt per cyclus) - terminal transferase activiteit : hecht een extra A (of ander nt) aan 3' uiteinden (een A indien alle dNTP’s aanwezig ; een B indien het individuele dBTP)

onjuiste inschatting juiste weergave A = 2n - 2n 1. 2 - 2 = 0 1. 2 - 2 = 0 2. 4 - 4 = 0 3. 8 - 6 = 2 4. 16 - 8 = 8 5. 32 - 10 = 22 6. 64 - 12 = 52 7. 128 -14 = 114 8. 256 -16 = 240 9. 512 -18 = 494 10. 1024-20 =1004 ... 20. 1.048.536 30. 1.073.741.764 onjuiste inschatting (230 = 1.073.741.824)

Vroege stappen in (vaak prenatale) diagnostiek met behulp van restrictie-analyse waren beperkt tot situaties waar een genetische afwijking samenging met het ontstaan of verdwijnen van een restrictieherkennings- sequentie in het genoom. (Vergelijk hier verder met analyse van cystic fibrosis met PCR fragment+restricitesplitsing) => restrictiesplitsing, scheiding op agarosegel, Southern blotting en hybridisatie met een sonde die het gebied overspant. * Korte historiek : 1971 : Kjell Kleppe, e.a. (Lab. Gobind Khorana) : gebruik van oligonucleotiden met DNA polymerase 1976 : Taq polymerase ontdekt 1976 : oprichting van Cetus Corporation : vooral gericht op erfelijke diagnostiek 1979 : K.Mullis in dienst genomen door Cetus, voor oligonucleotide syntheses als sondes in diverse projecten 1983 : oligonucleotiden voor sickle cell anemie ; pogingen tot analyse op genoom DNA met de Sanger’s dideoxyketenterminatietechniek (en Klenow polymerase) 1983-84 : knutselen met toevoegen van tweede primer, eerst zonder denaturatie, nadien met denaturatiestap Sept 1984 : poging tot mutatie assay (sickle cell anemie) : geen band zichtbaar op agarosegel Nov. 1984 : nieuwe poging met analyse via Southern blotting en hybridisatie : verwachte bandje van 110 bp zichtbaar (duidelijk dat de hoeveelheid toegenomen is) kloning en sequencing toont aan dat Klenow polymerase geen fouten heeft gemaakt Vanaf maart 1985 : patent applicaties (voor specifieke deeltoepassingen ; met Klenow polymerase) Sept 1986 : gebruik van Taq polymerase in PCR aangekondigd (in een meeting in Berlijn) Manuscript voor publicatie ingediend in oktober 1987, publicatie in voorjaar 1988. Patentaanvraag voor PCR met Taq polymerase ingediend in juni 1987, en toegekend in oktober 1990.

HhaI polymorfisme dicht bij de cystic fibrosis locus op chromosoom 7. Stalen (0.5 mg) van genomisch DNA werden geamplificeerd (30 cycli), gesplitst met HhaI, en gescheiden op agarosegel. Visualisatie van de fragmenten door UV fluorescentie na binding van ethidiumbromide. De polymorfe restrictieplaats wordt centraal gekozen. Indien aanwezig, splitst het 330 bp fragment tot twee 165 bp fragmenten. (Hierdoor is de intensiteit (door totale hoeveelheid DNA) voor beide loci dezelfde.) => onderscheid homozygoot of heterozygoot, en “gezond”, “drager” of “ziekte”.

Eigenschappen van enkele “vroege” thermostabiele DNA polymerasen Eén van de meer recente : Phusion DNA polymerase : afgeleid van Pfu DNA polymerase, met toevoeging van een processiviteitsverhogend domein. Error rate 50x kleiner dan Taq, 6x kleiner dan Pfu. Heeft 5’-3’ en 3’-5’ exo activiteiten, en produceert even uiteinden (dus geen TdT activiteit).

- voorbeelden van andere thermoresistente polymerasen: - Vent® polymerase uit Thermococcus litoralis, mét 3'-5' exo-activiteit, stabieler dan Taq - Deep Vent® polymerase uit Pyrococcus species GB-D; stabieler dan Vent polymerase (heeft nog 75% van zijn activiteit na 10 uur bij 95°C) - Bst polymerase uit Bacillus stearothermophilus - Tub polymerase - Tth polymerase uit Thermus thermophilus, met reverse transcriptase activiteit (Mn+2) - Ultma polymerase uit Thermotoga maritima, geen 5'-3' exo, wel 3'-5' exo-werking - Pfu polymerase uit Pyrococcus furiosus, mét 3'-5' exo activiteit - tal van genetische varianten met diverse eigenschappen o.a. mutant Taq polymerase zonder 5'-3' exo activiteit, Vent® (exo-), Deep Vent® (exo-) - Phusion DNA polymerase (zie tabel, vorige pagina) (zeer robuust enzym ; 10x hogere processiviteit dan Pfu polymerase ; zeer ruim toepassingsgebied) 5'-3' exo + 3'-5' exo - grote diversiteit aan matrijzen, slechts minimale hoeveelheden vereist in situ lyse van E.coli, B.subtilis, Streptomyces, gisten, dierlijke cellen, plantprotoplasten is voldoende (met beperkt aantal cellen : het DNA mag niet té extensief gedegradeerd zijn). Ook fossiel materiaal, microscoopglaasjes, bloedvlekken, enz.

* Effect van PCR-toestel Temperatuursprofielen, afhankelijk van de karakteristieken van de verschillende toestellen. Temperatuur binnenin het buisje : (a) drie waterbaden, met robotarm (b – e) programmeerbare heating/cooling blocks Cycling van 45°C, 72°C, 93°C “Ramping times” zijn belangrijk, want intussen blijft het polymerase actief, en kunnen de primers (ook foutief) binden. Vaak (vroeger meestal) wordt voor de 1ste cyclus een extra lange denaturatiestap toegevoegd (bvb. 20 minuten of meer), en na de laatste cyclus een langere elongatiestap. Dit heeft risico’s en/of consequenties.

- probleem van sensitiviteit versus risico van contaminatie Wat speelt zoal een rol? - probleem van sensitiviteit versus risico van contaminatie - groottes van amplicon : 200-2000 bp versus 2 - 5 kb versus 5 - 50 kb (long-range PCR) - amplificatieproces: - temperatuursprofiel, ‘touch-down’ PCR, - hot-start procedure (temperatuur of antilichamen) - extra startdenaturatie en extra eindelongatie A = E(n).2n Nf = No (1 + E(n))n Em = (Nf/No)1/n -1 amplificatie aantal moleculen gemiddelde efficientie per cyclus (foutieve interpretatie – zie hoger) - dalende efficientie vanaf +/- 1012 "targets" (of minder) (ongeveer 1 mg van een 1 kb DNA fragment) - toenemende amplicon lengte : "long-range" PCR : - overbrugging van defecten - gebruik van polymerasemengsels - primerkeuze : - grootte, %G+C (40-60%, balans tussen beide primers) - vermijd complementariteit tussen primeruiteinden, en binnenin de primers - mismatchen, staarten - andere factoren: buffer, additieven (KCl, DMSO, ...), Mg2+ concentratie, …

- start 2°C boven de berekende bindingstemperatuur van de primers ‘touch-down’ PCR - start 2°C boven de berekende bindingstemperatuur van de primers => stringente starts : - vermijden valse kopies, - maar minder efficiente toename - per 2 cycli een halve graad dalen ; na 8 cycli is de “optimale” temperatuur bereikt, na 16 cycli 2 graden lager : maar intussen is de hoeveelheid correcte matrijs substantiëel toegenomen. hot-start procedure (temperatuur of antilichamen) - temperatuur : toevoegen laatste component wanneer men minstens 20° C boven de bindingstemperatuur is. - dit kan zowel het polymerase, als de matrijs, als de primers zijn, of zelfs Mg2+,enz. extra startdenaturatie en extra eindelongatie : zie vorige 2 slides - indien DNA uit gelyseerde cellen komt, kan eveneens actief DNase aanwezig zijn - de TdT activiteit is zwak : dus korte eindelongatie geeft meer even uiteinden, lange eindelongatie geeft 3’ uitstekende A aan meer fragmenten "long-range" PCR : - overbrugging van defecten : inbouw van een “verkeerd” nucleotide vertraagt het polymerase, ook al is het zeer processief - gebruik van polymerasemengsels : toevoeging van een polymerase met 3’-5’ proefleesactiviteit corrigeert de foutieve inbouw. (Ze zijn meestal niet processief genoeg om zelf de lange afstanden te overbruggen.)

voorbeelden van toepassingen Basisobjectieven : - analytisch : - identificeren van de aanwezigheid van bepaalde sequenties of fragmentlengtes, vooral bij minimale beschikbaarheid van DNA) - synthetisch : - de aanmaak van voldoende hoeveelheden DNA voor verdere manipulaties, o.a. klonering, sequencing, enz.) voorbeelden van toepassingen - 'kloon analyse' : in kloneringsexperimenten (practicum/oefeningen) (i.p.v. plasmide-isolatie + restrictieanalyse) - screening : genetische afwijkingen en prenatale diagnose (diploid => homozygote, heterozygoot) “vaste” (of “voorspelbare”) hoeveelheid DNA : zie hoger voorbeeld van cystic fibrosis analyse - screening naar virusinfecties en andere pathogenen (vb. HIV, HCV, enz.) tot uiterste hoeveelheid DNA (1 partikel van het pathogeen) - diagnose van bacteriële infecties: medisch, veterinair, voedingsindustrie tot uiterste hoeveelheid DNA (laagst mogelijke hoeveelheid van het doelwit) - detectie van microörganismen in bodemstalen (bvb. opvolging bij 'field release' experimenten met GMO's)

Verhoging van de kloneringsefficientie van PCR fragmenten door het vormen van uitstekende uiteinden met 5' verlengde primers door restrictiesplitsing.

T/A klonering van PCR fragmenten met een 3’ uitstekende A. Vector kan bereid worden via “blunt end” splitsing, gevolgd door behandeling met Taq polymerase + dTTP (uitsluitend) om een extra T aan beide 3' uiteinden te hechten. Alternatief : een vector met twee HphI herkenningsplaatsen in anti-parallelle orientatie, zodat na splitsing er een enkelvoudige T blijft aan elk 3' uiteinde : cleavage mode of HphI nb. het gebied tussen de twee HphI plaatsen in de vector biedt mogelijkheden qua selectie of identificatie van recombinanten.

Varianten : nested PCR : voor de verhoging van de sensitiviteit (en rendement) met behoud van betrouwbaarheid. Interne en externe primers : (o.a.) verschil in bindingssterkte RT-PCR : (gebruik van reverse transcriptase, gebruik van Tth polymerase) (zie ook hoofdstuk 8) => mRNA: eerste-strengsynthese tot cDNA => tweede streng met DNA-primer tot ds-cDNA => verder PCR met twee specifieke primers gebruik van Tth polymerase (Mn2+) => ‘single-tube’ reactie A-PCR (asymmetrische PCR) : aanmaak van ssDNA (vooral voor sequentie-analyse) Inverse PCR (zie ook hoofdstuk 12 : plaatsgerichte mutagenese) RAcE (“Rapid Amplication of cDNA Ends) : 3’-RAcE en 5’-RAce (zie bij hoofdstuk 11 : cDNA banken) competitieve PCR real-time en (semi-)kwantitatieve PCR benaderingen (continue (fluorescente) detectie) incorporatie van nucleotide-analogen en etikettering (reeds vroeger gezien) N N

Varianten : RAPD, AFLP : multipele, selectieve amplicon vermenigvuldiging - RAPD : willekeurige binding (korte primer of laag-stringente condities) - AFLP : selectiviteit via restrictiefragmentatie en primeroverlap (Voornamelijk bij toepassingen in diversiteitsanalyse : NIET HIER behandeld) koppeling van DNA fragmenten SOE : 'splicing by overlap extension‘ LIC: ‘ligation-independent cloning’ (zelf geen PCR techniek, maar meestal slechts in combinatie met PCR te gebruiken) => langere ss-uiteinden creëren voor koppeling van DNA fragmenten (zie ook vroeger : eigenschappen van T4 DNA polymerase N

Nested PCR doel : verhoging van sensitiviteit met behoud van accuraatheid

N Asymmetrische PCR Aanmaak van enkelstrengig DNA

Inverse PCR Amplificatie om sequentieanalyse buiten de grenzen van een bekende sequentie mogelijk te maken. R1 (onvoorspelbaar) en R2 (voorspeld) zijn restrictieplaatsen. Een (zeer) complex mengsel wordt initieel bekomen, maar na “zelf-ligatie” (m.a.w. circularizatie) wordt alleen het gebied geflankeerd door primers a en b (oorspronkelijk in tegenovergestelde orientatie, nu naar elkaar wijzend) geamplificeerd door PCR. (R2 laat toe het doelwit te lineariseren ; dit is niet strikt nodig, maar toch efficienter tussen de (tien- of honderd)duizenden andere fragmenten) Zie ook bij plaatsgerichte mutagenese.

SOE : “splicing by overlap extension” amplicon-2 homologie amplicon-1 homologie amplicon-2 homologie amplicon-1 denaturatie renaturatie amplificatie SOE : “splicing by overlap extension” nb. de laatste stap is absoluut vereist, om het gekoppelde product uit het complexe mengsel als zuiver eindproduct te bekomen.

Real-time PCR DNA amplificatie curve, gebaseerd op fluorescentie van ethidiumbromide (gebonden aan dsDNA). Bij cyclus CT, overstijgt de fluorescentie de drempelwaarde (dicht bij de achtergrond vastgelegd) De achtergrond is hoog door de intrinsieke fluorescentie van ethidiumbromide. Dit kan vermeden worden door gebruik van o.a. SYBR Green I. Maar in beide gevallen blijft er het probleem dat deze verbindingen niet exclusief aan het normale ds-PCR product binden maar ook aan aspecifieke fragmenten, primers, enz. Daarom werd in nieuwere (meer instrumentele) technieken overgeschakeld naar sonde-gebaseerde systemen, vooral gebaseerd op fluorescente etiketten (“tags”), inclusief quenching mogelijkheden. (zie voorbeelden verder hieronder)

Initiële DNA concentratie versus DNA opbrengst, gemeten als toename van fluorescence

* Berekening van de efficientie (E) van een PCR reactie. CT waarden versus de logaritme van de initiële DNA concentratie (zie vorige figuur) * De logaritme van het aantal initiële doelwitmoleculen versus CT geeft een rechte lijn meet helling -1/logE (E = efficiëntie, maximum efficiëntie = 2)

Real-time kwantitatieve PCR (Taqman systeem) Vrijzetting van “reporter” is recht evenredig met de hoeveelheid geproduceerd amplicon DNA. Het gebruik van een set verschillende fluoroforen (verschillende kleuren) laat toe verschillende doelwitten in parallel te testen (als ze dezelfde amplificatieëfficiëntie hebben).

N

Molecular beacon tweede-orde kinetiek Quenching van fluorescentie indien de stam-lusstructuur samengehouden wordt. Binding aan het doelwit verbreekt de korte helix en scheidt fluorofoor van quencher. tweede-orde kinetiek

Gebruik van Scorpion probes eerste-orde kinetiek Intramoleculaire hybridisatie van de verlengde sequentie onderbreekt de quenching van de fluorescentie. eerste-orde kinetiek (veel sneller dan met molecular beacon)

* R6G

LIC : Ligation-independent cloning (zie ook Deel 4 : gebruik van T4 DNA polymerase) - Vector, gesplitst met SmaI : fragment 1 - Te insereren DNA fragment : fragment 2 : aangemaakt door PCR met primers met 5' staarten die passen in de vectoruiteinden (zie figuur). de fragmenten kunnen niet zelf-sluiten.

Addendum (zie ook Deel 4) LCR : ligase chain reaction : gebaseerd op hetzelfde concept als PCR een techniek van ligase reactiecycli (met een thermostabiel ligase) gebruik in diagnose (bvb. van mutanten) => "amplificatie" van geligeerde oligonucleotiden alleen toepasbaar met een ligase dat geen “blunt end ligatie” activiteit heeft p (Exponentiële) accumulatie van geligeerde oligonucleotiden indien er perfecte complementariteit is ter hoogte van de “nick”. Het “product” van elke ligatiereactie wordt (extra) substraat in de volgende cyclus.

vervolg 'ligase chain reaction' (geen PCR techniek maar similair cyclisch concept en in combinatie ermee te gebruiken) - 4 oligonucleotiden, twee aan twee complementair (even uiteinden als duplex) - hun aaneenschakeling vereist een matrijs die perfect complementair is => het product wordt substraat (matrijs) in een volgende ligatiereactie - gebruik van thermoresistente ligase (bvb. Pfu ligase) in een ligatiecyclus met denaturatie, annealing en koppelingsreactie. - het ligase mag geen "blunt-end" ligatie-activiteit vertonen - indien de initiële matrijs perfect complementair is, wordt "exponentieel" product aangemaakt - Toepassing : in diagnostiek van mutaties in een genoom (erfelijke diagnostiek)