Technieken & toepassingen 20. BIOTECHNOLOGIE Technieken & toepassingen

DEFINITIE Biotechnologie: bios, technologie - Klassieke biotechnologie - Moderne biotechnologie ▫ onderzoeken van levensprocessen in organismen en deze desgewenst gebruiken, aanpassen voor toepassingen in geneeskunde, landbouw, forensisch onderzoek, … ▫ genomics, transcriptomics, proteomics

Genetisch wijzigen van organismen Biotechnologische toepassingen Biotechnologische technieken Biotechnologisch debat

NATUURLIJKE GENOVERDRACHT 1 streng DNA plasmiden

NATUURLIJKE GENOVERDRACHT BACTERIE NAAR PLANT Ti-plasmide (tumorinducerend plasmide)

NATUURLIJKE GENOVERDRACHT BACTERIE NAAR PLANT

NATUURLIJKE GENOVERDRACHT BACTERIE NAAR BACTERIE

NATUURLIJKE GENOVERDRACHT BACTERIE NAAR BACTERIE conjugatie

NATUURLIJKE GENOVERDRACHT VIRUS NAAR BACTERIE nucleïnezuur: DNA of RNA eiwitmantel envelop: vetten + glycoproteïnen obligaat parasiet

NATUURLIJKE GENOVERDRACHT VIRUS NAAR BACTERIE bacteriofaag kop + staartstuk

NATUURLIJKE GENOVERDRACHT

NATUURLIJKE GENOVERDRACHT BACTERIE NAAR BACTERIE VIA VIRUS Transductie: DNA-overdracht van een bacterie op een andere bacterie via een faag

NATUURLIJKE GENOVERDRACHT VIRUS NAAR DIER DNA-virus - RNA-virus ▫ herpesvirus ▫ polio ▫ papovavirus ▫ mazelen ▫ adenovirus en rhinovirus ▫ griep ▫ hepatitis B-virus ▫ hondsdolheid ▫ Ebola-virus

NATUURLIJKE GENOVERDRACHT VIRUS NAAR DIER retrovirus RNA-virus met DNA-polymerase  transcriptie van RNA in DNA = copy-DNA (cDNA)  reversetranscriptase ~ retrovirus

NATUURLIJKE GENOVERDRACHT 1. retrovirus dringt cel binnen 2. envelop versmelt met plasmamembraan + eiwitmantel lost op 3. reversetranscriptie 4.- 5. cDNA  in DNA cel 6.- 7. wordt omgezet naar RNA + translatie 8. nieuwe virussen verlaten cel

KUNSTMATIGE GENOVERDRACHT BACTERIE NAAR BACTERIE Restrictie-enzymen: verbreken bindingen ter hoogte van welbepaalde nucleotidensequenties Het geknipte fragment heeft 2 uiteinden die enkelstrengig zijn = sticky ends

KUNSTMATIGE GENOVERDRACHT

KUNSTMATIGE GENOVERDRACHT BACTERIE NAAR BACTERIE 1973: Cohen en Boyer  m.b.v. restrictie-enzymen vreemd gen in bacterie binnenbrengen Plasmide met tetracycline-resistentie + plasmide met penicilline-resistentie + restrictie-enzym + DNA-ligase  nieuwe plasmide resistent tegen beide antibiotica Recombinant DNA: DNA ontstaan door DNA van diverse herkomst bij elkaar te brengen

KUNSTMATIGE GENOVERDRACHT

KUNSTMATIGE GENOVERDRACHT BACTERIE NAAR BACTERIE Genetic engineering = DNA-technologie = gentechnologie = recombinant DNA-technologie = genmanipulatie = genetische manipulatie = genetische modificatie  gericht wijzigen van genetische informatie in een organisme = genetisch gemodificeerde organismen (GGO’s) of transgene organismen

Genetisch wijzigen van organismen Biotechnologische toepassingen Biotechnologische technieken Biotechnologisch debat

KUNSTMATIGE GENOVERDRACHT GENEESKUNDIGE TOEPASSINGEN Productie van geneesmiddelen Insuline Groeihormoon EPO Productie van vaccins Gentherapie Stamceltherapie

KUNSTMATIGE GENOVERDRACHT GENEESKUNDIGE TOEPASSINGEN Insuline 1921: zuivering en isolatie Isolatie uit pancreas koeien en varkens Nu: insuline aanmaak in GGO’s (bacteriën, gisten)  biotech-insuline

KUNSTMATIGE GENOVERDRACHT 1. gen voor α-keten en gen voor β-keten m.b.v. restrictie-enzymen geïsoleerd 2. elk gen in afzonderlijk plasmide, ge- koppeld aan gen voor galactosidase (lactose  glucose + galactose) 3.- 4. lactose is enige voedselbron  bacteriën vermeerderen + aanmaak galactosidase-insuline complex 5. complex isoleren en zuiveren 6. galactosidase-deel wordt verwijderd α-keten en β-keten aan elkaar gezet

KUNSTMATIGE GENOVERDRACHT GENEESKUNDIGE TOEPASSINGEN EPO (erythropoïetine) Productie van EPO door nieren Stimuleert aanmaak rode bloedcellen EPO-concentraties in bloed heel laag  bloedtransfusies met extra rbc  tijdelijk effect + risico besmetting met virussen (hiv) Genetisch gewijzigde ovariumcellen van Chinese hamster  voldoende en biologisch actief EPO

KUNSTMATIGE GENOVERDRACHT

KUNSTMATIGE GENOVERDRACHT GENEESKUNDIGE TOEPASSINGEN Productie van vaccins Klassiek vaccin: injectie van verzwakte ziekteverwekkers  productie van antilichamen Gentechnologisch vaccin: gen dat code voor eiwitten op buitenkant virussen bevat inbrengen in onschadelijk virus  wordt in dierlijke cellen vermeerderd  onschadelijk virusmengsel  productie van antilichamen

KUNSTMATIGE GENOVERDRACHT GENEESKUNDIGE TOEPASSINGEN Gentherapie Foutieve gen vervangen door een goed werkend gen In lichaamscellen waarbij foutieve gen en ziekte wordt hersteld in patiënt zelf = therapeutisch effect of genotypisch geneesmiddel Ingebrachte gen = juiste versie van fout gen of nieuw gen dat corrigerend werkt

KUNSTMATIGE GENOVERDRACHT GENEESKUNDIGE TOEPASSINGEN Gentherapie CIDS: congenitaal immuniteitsdeficiëntie-syndroom  defect in gen voor enzym ADA (adenosinedeaminase) ADA  geen productie witte bloedcellen Beenmergcellen van patiënt + correcte versie van ADA-gen

KUNSTMATIGE GENOVERDRACHT

KUNSTMATIGE GENOVERDRACHT LANDBOUWKUNDIGE TOEPASSINGEN Vroeger: generaties lang kruisingen van planten  gewenste + ongewenste eigenschappen! Nu: gewenste eigenschappen worden gericht in gewas gebracht door genetische transformatie 1985: Van Montagu & Schell  1e transgene planten Kleurverandering, insectresistenie, herbicide-tolerantie, langere houdbaarheid, grotere en meerdere vruchten,…

KUNSTMATIGE GENOVERDRACHT LANDBOUWKUNDIGE TOEPASSINGEN Insectresistente planten Planten bestand tegen onkruidverdelger Planten met specifieke kwaliteiten: Flavr Savr-tomaten blauw katoen golden rice aardappelen met meer zetmeel soja en koolzaad die gezondere vetten maken productie van vaccins

KUNSTMATIGE GENOVERDRACHT LANDBOUWKUNDIGE TOEPASSINGEN Transgene planten die zelf insecticide aanmaken Gen dat voor Bacillus thuringiensis-toxine (Bt-toxine) codeert overbrengen naar plant

KUNSTMATIGE GENOVERDRACHT 1. gen voor Bt-toxine wordt gekloond in colibacil 2. door recombinant- DNA-technologie plasmide samenstellen 3. plasmide inbrengen in agrobacterie 4. agrobacterie infecteert protoplasten 5. bacterie draagt T-DNA over aan tabaksplant 6. plantencellen worden opgekweekt 7. volwassen tabaksplant brengt gen tot expressie

KUNSTMATIGE GENOVERDRACHT LANDBOUWKUNDIGE TOEPASSINGEN Transgene planten die resistent zijn tegen onkruid-verdelgers Soja, tabak, maïs,… herbicidetolerantiegen tegen Roundup Voordelen: verminderd gebruik van herbiciden, kostenbesparend Nadelen: contaminatie van niet-gewijzigde planten, onzekerheid over gezondheid,…

KUNSTMATIGE GENOVERDRACHT FORENSISCH ONDERZOEK DNA-fingerprint Aanleg en beheer van genenbanken met daderprofielen Vaderschapstest (fig. p.73) VNTR Verschillende regio’s testen

Genetisch wijzigen van organismen Biotechnologische toepassingen Biotechnologische technieken Biotechnologisch debat

TECHNIEKEN KLONEN Natuurlijk klonen ▫ bacteriën ▫ eeneiige tweelingen Reproductief klonen ▫ gebruik van celkern van gedifferentieerde cellen Therapeutisch klonen ▫ gebruik van stamcellen om cellen en weefsels te maken die gebruikt worden om mensen te genezen

TECHNIEKEN

TECHNIEKEN Therapeutisch klonen brandwondencentra: huidcellen kweken van hele organen, ruggenmerg, been en kraakbeen embryonale stamcellen  spiercel, niercel, levercel,…

TECHNIEKEN AGAROSE-GEL-ELEKTROFERESE DNA-fragmenten van verschillende lengtes van elkaar scheiden Elektroforesetank: gel + bufferoplossing + DNA Elektrische spanning  DNA-fragmenten migreren (korte sneller dan lange)  bandenpatroon

TECHNIEKEN

TECHNIEKEN PCR Onderzoek: kleine hoeveelheden DNA Vroeger: (tot 1987) fragmenten in plasmide van bacterie  bacterie vermeerdert  voldoende DNA Nu: (vanaf 1987) PCR of polymerase chain reaction Stukjes DNA synthetiseren op basis van een DNA-staal 2 primers + kunstmatige nucleotiden

TECHNIEKEN

TECHNIEKEN

TECHNIEKEN DNA-SEQUENTIE ANALYSE Basenvolgorde in DNA-fragment bepalen 1 primer + kunstmatige nucleotiden + fluorescerende kunstmatige nucleotiden ( stoppen de ketenverlenging) Agaraso-gel + laser: fluorescentiesignaal wordt gelezen en omgezet in DNA-sequentie

TECHNIEKEN

TECHNIEKEN

TECHNIEKEN RFLP Restrictie fragment lengtepolymorfisme Gebruik van restrictie-enzymen om DNA in stukjes te knippen  deze stukjes verschillen van persoon tot persoon in lengte  zo kan men ook ziektes opsporen Sikkelcel: Mst II knipt in de volgorde CCTNAGG (N is gelijk welke base) normale allel: ACTCCTGAGGAG sikkelcelallel: ACTCCTGTGGAG

TECHNIEKEN

Genetisch wijzigen van organismen Biotechnologische toepassingen Biotechnologische technieken Biotechnologisch debat

BIOTECHNOLOGISCH DEBAT GGO’s - voordelen - nadelen Stamceltherapie DEBAT DEBAT