Foetaal DNA in maternaal bloed : bruikbaar vandaag? Lieve Christiaens Peter Scheffer Ellen vd Schoot Masja de Haas VVOG Gent 23 oktober 2009

Fetaal DNA in maternaal plasma : de basis Lo en Chiu, Nature 2007

Niet invasieve prenatale genotypering in niet celgebonden fetaal DNA in maternaal plasma Vroegste aanwezigheid Zwangerschapsduur van 5 wk (Rijnders et al.) Extreem lage concentratie Ongeveer 50 genoom equivalenten/ml (range 3-1000 geq/ml) Overmaat aan maternaal niet celgebonden DNA Foetale DNA is 4 % van het totale plasma DNA (range 1-90%) Foetaal DNA is gefragmenteerd: < 300 bp Snelle klaring uit de maternale circulatie postpartum T 1/2 = 16 minuten (range 4-30 minuten)(Lo et al.)

Allel-specifieke PCR assay (ASPA) Volledige match van allel-specifieke primer: G PRODUKT C Geen 3’-match van allel-specifieke primer: T GEEN PRODUKT C

Aantonen : Real time amplificatie 500 copies fluorescentie 5 copies 50 copies Aantal PCR cycli

Real-time PCR analyse Avent, 2006

Toepassingen detectie foetaal DNA in maternaal plasma Fetale geslachtsbepaling bij risico op geslachtsgebonden ziektes of op adrenogenitaal syndroom Fetale genotypering voor bloedgroepen (rode bloedcellen en bloedplaatjes) Fetale genotypering voor monogeen overervende aandoeningen (de novo, autosomaal dominant van paternale origine, autosomaal recessief met twee verschillende mutaties) Down syndroom?

Fetaal geslacht

Geslachtsgebonden ziektes

Adrenogenitaal syndroom ♀ Teveel androgenen ♂ Fotos M Devroede en M Jansen Gezondheidswinst : voorkomen van onjuiste geslachtstoekenning bij meisjes voorkomen langdurige blootstelling aan androgenen groeistoornissen, ‘short stature’, vervroegde puberteit onderkennen dragerschap binnen een familie voorkomen virilisatie meisjes bij volgende zwangerschap

Foetale geslachtsbepaling in maternaal bloed (n=201) 112 SRY of SRY en DYS14  ♂; follow up : concordant 87 SRY of SRY en DYS 14 negatief 77 ♀; follow up : concordant 2 niet conclusief miskramen Foetaal DNA? Sanquin Amsterdam 2003-2008 2 dna isolaties In elke 3 pcrs voor SRY en 2 voor DYS 14 SRY and DYS 14 resultaten moeten concordant zijn mannelijk : minstens 4/6 SRY en 4/4 DYS 14 pcrs positief vrouwelijk : minstens 5/6 SRY and 3/4 DYS 14 pcrs negatief Follow up bij 139 46 Minstens 1 homozygoot systeem informatief Alleen heterozygote systemen informatief 2 Geen informatieve systemen Acht van de 10 de patienten waarbij geen uitslag waren meisjes, 2 nog geen follow up Insturen via klinisch geneticus in consultatie met gynaecoloog voor echo 11

Controle voor fetaal DNA Van vader geërfde bloedgroepantigenen (Rh C, c, D, E, e or K) Biallelische insertie/deletie polymorphismen (indels)

Biallelische insertie/deletie polymorphismen Screening van vaderlijk en moederlijk genomisch DNA uit witte bloedcellen op potentiële fetale markers Allele a …AATTCTCAGGTCAATGG… Allele b …AATTCTCAGAAAGGTCAATGG… Voorbeeld moeder homozygoot voor allel a en vader heterozygoot voor allel b -> allel b potentiële marker

Foetale geslachtsbepaling in maternaal bloed 87 SRY of SRY en DYS negatieve casus 64 Paternale merker  Homozygote vs heterozygote systemen; ♀ 9 Paternale bloedgroepmerker  Rh D, E en c; ♀ 4 Aanwezigheid niet-maternale merker Geen materiaal vader voorhanden; ♀ 5 Paternale merker negatief Vader heterozygoot; geen uitslag 3 Paternale merker niet conclusief [achtergrond]; geen uitslag 1 Geen informatieve allelen geen uitslag Plasma op 10/201 geen uitslag; follow up : alle ♀

Resultaten MEISJE JONGEN NIET CONCLUSIEF Maternaal bloed monster N=201 SRY/DYS14 positief n=112 SRY/DYS14 negatief n=87 SRY/DYS14 niet conclusief n=2 Aanwezigheid fetaal DNA bevestigd n=77 MISKRAAM MEISJE Aanwezigheid fetaal DNA NIET bevestigd n=10 JONGEN NIET CONCLUSIEF

Resultaten vs uitkomsten MEISJE n=77 JONGEN n=112 NIET CONCLUSIEF n=10 105 5 2 71 4 10 *Zoals vastgesteld uit karyotypering, echoscopisch onderzoek en/of na geboorte Jongen Meisje Miskraam Onbekend UITKOMST*

Caveat : echoscopisch onderzoek voorafgaand aan bloedafname : vitaliteit, meerling, tweede lege vruchtzak?

Bloedgroepantigenen

Rode bloedcel en bloedplaatjes bloedgroepen Klinisch relevante erythrocytenantistoffen bij 0,4 % van de zwangeren (=21000 vrouwen per jaar in de Europese Unie (Koelewijn et al 2008) 40 % van de anti D profylaxe niet nodig Bloedplaatjesantistoffen gericht tegen HPA1a komen voor bij 0,3-0,5 % van de zwangeren (= 16000-26000 vrouwen per jaar in de Europese Unie (Kjeldsen-Kraghl et al. 2007) Bloodproduct Volunteer, hyperimmunized donors World wide shortage Costs

Meta-analyse over RhD genotypering (Geifman-Holzman AJOG 2006) 32 artikelen 1998-2005: Maternaal cffDNA D+/- 2777/2885: 96,25% 10 studies reported 100% diagnostic accuracy Meta-analyse over RhCE typering (Geifman-Holzman BJOG 2009): 6 artikelen 1998-2007 Maternaal cff DNA c/C: 147/147: 100% Maternaal cff DNA E/e: 153/153: 100% www.safenoe.org 20

Screening RhD negatieve zwangeren bij 30 wk : concordante resultaten bij 99.4% van de geteste patienten (n=1257) 787 5 3* 458 * + 4 false negative serological results Studies elders in Europa UK Germany France Interim results show >99.2% concordancy In de EU jaarlijks 21000 vrouwen met klinisch relevante erythrocyten antistoffen (0,4 %) (Koelewijn) en vergelijkbare aantallen voor bloedplaatjesantistoffen

Fout positieven (klinisch minder relevant) Contaminatie : Moet voorkomen worden Juiste controles meenemen Silent RHD genen Testopzet (RHDpseudogene, exon10) Fout negatieven : klinisch van groot belang bij vrouwen met antistoffen Variant RHD genen Testopzet (multiple exons) Te weinig fetaal DNA Fetale marker (Y, paternale marker) www.safenoe.org 22

Waardoor worden discrepanties veroorzaakt? Genotype Serology RHCE RHD RHD D-positive allele RHCE . D-negative allele Bij negroiede personen uit Afrika kan D-negativiteit ook veroorzaakt worden door variant RHD genen RHCE RHD RHDψ D-negative allele r’s RHCE RHD 3-8 D-negative allele

Kosteneffectiviteit Alle niet gesensibiliseerde Rh D negatieve vrouwen (34.000) antiD profylaxe : 6,6 Miljoen Euro Alleen niet gesensibliseerde Rh D negatieve vrouwen wiens foetus Rh D positief is (PCR) krijgen anti D profylaxe : 3,9 Miljoen Euro 1/200000 vrouwen zal geimmuniseerd zijn omwille van introductie van antenatale RhD typering SAFE : minder immunizaties (iedereen anti D), minder blootstelling aan bloedproducten, minder noodzaak om vrijwilligers te immunizeren

Conclusies tav fetale erythrocytentypering Geautomatiseerde non-invasieve fetale RhD genotypering in de 30e week is op even betrouwbaar als serologisch onderzoek in navelstrengbloed (>99%) Invoeren van foetale Rh D genotypering in maternaal plasma bij 30 wk en beperken van de Rh D profylaxe tot vrouwen met een negatieve Rh D PCR is kosteneffectief Niet invasive bloedgroep genotypering bij vrouwen met allo immuunantistoffen is betrouwbaar (RhD, Rhc, RHE, HPA-1a, Kell) Invasieve diagnostische procedures voor foetale bloedgroeptypering zijn obsoleet geworden 1/200000 vrouwen zal geimmuniseerd worden wegens introductie van antenatale foetale Rh D typering 40 % van de 34000 Rh D negatieve vrouwen (13600 vrouwen geen anti D profylaxe nodig)

Diagnostiek HPA-1a negatieve zwangeren met anti HPA-1a antistoffen (n=34) Submitted SGI 2010 Studies elders in Europa UK Germany France Interim results show >99.2% concordancy In de EU jaarlijks 21000 vrouwen met klinisch relevante erythrocyten antistoffen (0,4 %) (Koelewijn) en vergelijkbare aantallen voor bloedplaatjesantistoffen

Down syndroom?

Down syndroom diagnostiek in maternaal plasma Lo and Chiu, Nature reviews Genetics 2007

Met dank aan Sanquin Aicha Ait Soussan Bernadette Bossers Masja de Haas Ellen van der Schoot Peter Scheffer Petra Maaskant-van Wijk