Identificatie van nieuwe celdood mediatoren via RNAi Annelies Vervaeke Farmaceutische en biologische laboratoriumtechnologie Stagementor: Sasker Grootjans Lector: Anneleen Cottyn 2012-2013

Inhoud 1. Geprogrammeerde celdood 2. Doelstelling 3. Resultaten en discussie 4. Besluit

1. Geprogrammeerde celdood In het laboratorium voor Moleculaire Signaaltransductie wordt onderzoek gevoerd naar de verschillende signaaltransductiewegen of 'pathways' die tot geprogrammeerde celdood leiden. Bij dit project wordt meerbepaald onderzoek gedaan naar necroptose en apoptose. Bij geprogrammeerde celdood zorgt een stimulus voor een signaalcascade, die leidt tot biochemische en moleculaire reacties op diverse subcellulaire niveaus. Deze resulteren in apoptose, necroptose of andere vormen van geprogrammeerde celdood. Bij apoptose resulteert de specifieke signalisatieweg in de activering van een bepaalde familie van caspases. Deze zorgen voor de proteolyse. De afgegeven visikels met cytoplasmatische porties ongewijzigde organellen worden door middel van fagocytose verwijderd. Bijgevolg is er geen inflammatoire reactie , in tegenstelling tot bij necroptose. Bij necroptose komt de cellulaire inhoud na openbarsten van de cel vrij en veroorzaakt een inflammatoire reactie, Apoptose wordt bij dit experiment geïnitieerd in L929 cellen door binden van Fas ligand op de receptor, necroptose door binden van Tumor Necrose Factor. Bij deze processen die in gang gezet worden, pathways genoemd, zijn er reeds heel wat mediatoren gekarakteriseerd. Toch is de rol van een groot aantal moleculen nog onbekend. Door meer inzicht te krijgen in de apoptose en necroptose ‘pathway’, hoopt men tot nieuwe ontwikkelingen te komen voor de behandeling van verschillende aandoeningen (kanker, infarcten,…)

Inhoud 1. Geprogrammeerde celdood 2. Doelstelling 2.1. ‘Knock-down’ a.d.h.v. miRNA constructen 2.2. Lentivirale overdracht 2.3. Kloneren van de pLenti expressie vector 3. Resultaten en discussie 4. Besluit

2. Doelstelling 2.1. ‘Knock-down’ veroorzaakt door miRNA constructen ‘Post Transcriptional Gene Silencing (PTGS)’ mechanisme  translatie gen

Toegepaste technieken 2. Doelstelling 2.2. Lentivirale overdracht Toegepaste technieken Transfectie ‘packaging’ vector enveloppe vector Transductie naar L929 cellen Meten effect van ‘knock-down’ op (caspase-activatie bij): Apoptose Necroptose TNF/FasL ‘Knock-down’ target mRNA

2. Doelstelling 2.3. Kloneren van de pLenti6 expressie vector Met pDEST = destinatie vector pENTR = ‘entry’ vector Plaatsgerichte mutagenese BsmBI-digest T4-ligatie ‘Insert’ (dsDNA) BalI BsmBI BsmBI Gateway® LR-recombinatie +

2. Doelstelling 2.3. Kloneren van de pLenti6 expressie vector Gen Nummer van het primerpaar geligeerd in de pLenti expressie vector  Verwijst eveneens naar het construct A 1 2 B 3 4 C 5 D 6 7 E 8 9

Inhoud 1. Geprogrammeerde celdood 2. Doelstelling 3. Resultaten en discussie 3.1. Controleren van de plaatsgerichte mutagenese 3.2. Controleren van de T4-ligatie 3.3. Controleren van de LR-reactie 4. Besluit

Plaatsgerichte mutagenese 3. Resultaten en discussie Plaatsgerichte mutagenese BsmBI-digest (controle) Open knippen vector

3. Resultaten en discussie 3.1. Controleren van de plaatsgerichte mutagenese BsmBI-digest Resultaat: de ongewenste knipplaats is overal verwijderd 3138 bp

Plaatsgerichte mutagenese 3. Resultaten en discussie Plaatsgerichte mutagenese BsmBI-digest (controle) T4-ligatie Open knippen vector Annealen primers tot dsDNA Transformatie Controle-PCR Controle-digest

3. Resultaten en discussie 3.2. Controleren van de T4-ligatie 3.2.1. Kolonie-PCR Éénzelfde primerpaar Resultaat: elk ‘insert’ is opgenomen weinig zelfsluiting (controle bij transformatie) 140 bp 140 bp

3. Resultaten en discussie 3.2. Controleren van de T4-ligatie 3.2.2. Digest DraI  2 ≠ banden Resultaat: weinig onderlinge ligatie van plasmiden 2383bp 755bp SmartLadder: I=10 000bp, II=5000bp, III=3000bp, IV= 2500bp, V=2000bp, VI=1000bp, VII=800 en VIII=600bp

Plaatsgerichte mutagenese 3. Resultaten en discussie Plaatsgerichte mutagenese BsmBI-digest (controle) Open knippen vector Annealen primers tot dsDNA LR-recombinatie Construct? T4-ligatie Transformatie Controle-PCR Transformatie Controle-digest Controle-PCR Controle-digest

3. Resultaten en discussie 3.2. Controleren van de LR-recombinatie 3.2.1. Kolonie-PCR Éénzelfde primerpaar Kleine kolonies (laan E-H) en grote kolonies (laan A-D) per getransformeerde plaat testen Resultaat: elk ‘insert’ is opgenomen 500 bp 500 bp

3. Resultaten en discussie 3.2. Controleren van de LR-recombinatie 3.2.2. Digest Kleine kolonies (laan H en G) en een grote kolonie (laan D) (allen positief na kolonie-PCR) per getransformeerde plaat testen - BalI  2 ≠ banden Resultaat: incorrecte onderlinge recombinaties 2383 bp 755 bp Met: C=controle en S=‘scrambled’ controle SmartLadder:10 000bp, II=8000bp, III=6000bp, IV=5000bp, V=4000bp, VI=3000bp, VII=2500, VIII=400bp en IX=200bp

Inhoud Geprogrammeerde celdood Doelstelling Resultaten en discussie Besluit

4. Besluit ‘Knock-down’ target mRNA Meten effect van ‘knock-down’ op (caspase-activatie bij): Apoptose Necroptose TNF/FasL Transfectie ‘packaging’ vector enveloppe vector Transductie naar L929 cellen ‘Knock-down’ target mRNA

4. Besluit Laatste ontwikkelingen in het onderzoek Nieuwe mediator  gen D (construct 7) = celdood inhibitor ‘European Bioinformatics Institute’ (EBI)  In sommige kankertypes, overexpressie van gen D Verder in vitro en in vivo onderzoek  Mogelijks een target voor de ontwikkeling van behandelingen tegen aandoeningen (kanker, hart- en herseninfarcten…)

Identificatie van nieuwe celdood mediatoren via RNAi Annelies Vervaeke Farmaceutische en biologische laboratoriumtechnologie Stagementor: Sasker Grootjans Lector: Anneleen Cottyn 2012-2013

Cell death assays: enzymatic MTT assay Lactate dehydrogenase NAD+ NADH + H+ NAD+ LDH Dia-phorase Iodonitrotetraformazan Lactate Pyruvate Iodonitrotetrazolium chloride

Cell death assays: DNA dyes Flow cytometer BD Pathway 1000 fold intensity shift Live Dead OR Live Dead-necrosis Dead-apoptosis

New cell death assay: Fluostar Sytox green: intensity shift after DNA binding Can be used to identify cell death No metabolic bias Plate reader (96 well): Temperature incubator (37°C) Reads Fluorescence Intensity Top/bottom reading 8 sequential filter combinations 15 sec per filter (entire plate) 10 min entire plate, 8 filters Problem for mamalian cells: C02-conditioned medium Use CO2-independent medium (Leibovitz) Evaporation Leave lid on plate, use bottom reading 1000 fold intensity shift

Cell death on fluostar L929 fibrosarcoma: TNF = necrosis Sytox Green: Ex 480nm, Em 540nm L929 fibrosarcoma: TNF = necrosis Fas = apoptosis Ac-DEVD-AMC (7-Amino-4-methylcoumarin) Ex.: 340-360nm, Em.: 440-460nm CASP3 DEVD DEVD AMC AMC Sytox green + DEVD-amc: Reproducible cell death kinetics Discrimination between apoptosis & necrosis

Cell death assays: overview Flow Cytometer BD Pathway Fluostar MTT-assay Principle Membrane impermeable dye Mitochondrial activity Time required 96 well: 30 min- 1h 96 well: 45 min 96 wel: 10 min 96 wel: 4 hours-overnight High throughput 1 plate for each timepoint 1 plate for 2 timepoints (toxicity laser) 1 plate for all timepoints 1 plate per timepoint Endpoint/ continuous endpoint Semi-continuous Cell death type identification Only for reporter cell lines Nuclear shrinking & chromatin condensation Caspase activation Not possible Single cell/population Single cell -> population population