Plantengroeibevordering door rhizobacteriën Tibby Deckers Bachelor in Farmaceutische en Biologische laboratoriumtechnologie VIB Department of Plant System Biology De focus van het onderzoek is biobemesting door middel van plantengroeibevorderende bacteriën. Dit zijn bacteriën die plantengroei kunnen bevorderen. Een specifieke groep onder deze groep bacteriën zijn de bacteriën die vrij leven in de rhizosfeer van de plant, namelijk de plantengroeibevorderende rhizobacteriën. Er werd een collectie van 127 rhizobacteriën gebruikt om na te gaan of er een stimulatie is in de groei van de wortel of de scheut van planten. Dit werd getest op zowel Arabidopsis thaliana als maïs.   De reden waarom maïs gebruikt wordt is door een wereldwijde hoge consumptie van maïs. Deze hoge consumptie zorgt ervoor dat er niet genoeg maïs zal zijn voor zowel mens als dier in de toekomst.

Inhoud Inleiding Methodologie Resultaten & Discussie Conclusie Rhizosfeer Natuurlijke microflora van de rhizosfeer Arabidopsis thaliana Maïs Methodologie Opgroeien rhizobacteriën Zea mays Resultaten & Discussie Optimalisatie opgroeien rhizobacteriën Arabidopsis Thaliana Conclusie Plantengroeibevordering door rhizobacteriën

Rhizosfeer = de interface tussen de wortel en de bodem die gekoloniseerd wordt door een grote hoeveelheid aan unieke micro-organismen Drie belangrijke delen: Endorhizosfeer Rhizoplane Ectorhizosfeer De rhizosfeer is de interface tussen de wortel en de bodem, die gekoloniseerd wordt door een grote hoeveelheid aan unieke micro-orgnanismen, dit wordt ook de natuurlijke microflora genoemd. De reden voor het voorkomen van deze unieke micro-organismen is door de secretie van exudaten zoals suikers en vitaminen.   De rhizosfeer bestaat uit drie belangrijke delen, namelijk de endorhizosfeer, de rhizoplane en de ectorhizosfeer. Plantengroeibevordering door rhizobacteriën

Rhizosfeer Op de figuur is de endorhizosfeer aangeduid met de witte pijl. De endorhizosfeer omvat de epidermis, de cotrex cellen en de wortelharen.   De rhizoplane is aangegeven met de gele lijn. Het is het deel van de worteld dat in direct contact staat met de aardlaag. Op dit gedeelte kunnen de bacteriën zich gemakkelijk vasthechten, omdat de plant zoals eerder vermeld exudaten afscheidt die voordelig zijn voor de bacteriën. De ectorhizosfeer is aangegeven door door de gele pijl. De ectorhizosfeer is de aardlaag, die het dichtst tegen de wortel ligt. Plantengroeibevordering door rhizobacteriën

Natuurlijke microflora van de rhizosfeer Omvat alle micro-organismen die voorkomen in de rhizosfeer De natuurlijke rhizosfeer microflora bevat alle micro-organismen waaronder de bacteriën die voorkomen in de rhizosfeer. Het soort bacteriën die hier aanwezig zijn hangt af van de beschikbare metabolieten, de groei van de plant en de samenstelling van de bodem.   De meest voorkomende micro-organismen zijn bacteriën en schimmels, maar ook protozoa, nematoden, algen en virussen worden daar gedetecteerd. Afhankelijk van hun effect op de plant kunnen ze ingedeeld worden in drie soorten, namelijk de goede micro-organismen, de pathogene micro-organismen en de voor de mens pathogene micro-organismen. Plantengroeibevordering door rhizobacteriën

Natuurlijke microflora van de rhizosfeer De goede micro-organismen De goede micro-organismen zijn die micro-organismen die een verbetering in de groei van de plant veroorzaken door middel van een aantal factoren, namelijk een betere opname van voedingsstoffen, bescherming tegen pathogenen, activatie van het immuunsysteem, verbeterd metabolisme en bescherming tegen abiotische stress.   Onder de goede micro-organismen vallen de rhizobacteriën die gebruikt worden in het onderzoek. De rhizobacteriën zijn die bacteriën die voorkomen in de rhizosfeer van de plant en als ze groei bevorderen worden ze plantengroeibevorderende rhizobacteriën genoemd. Eén van de werkwijzen van de plantengroeibevorderende rhizobacteriën is het verbeteren van de opname van voedingstoofen door het wortelsysteem. Er zijn drie belangrijke voedingsstoffen die opgenomen worden door de plant, stikstof, fofor en ijzer. De rhizobacteriën helpen door stikstof te fixeren, fosfor om te zetten in oplosbare fosfor en ijzer te produceren. De rhizobacteriën kunnen ook een invloed hebben op de productie van plantenhormonen, enzymen die de celwand van pathogenen afbreken en secundaire metabolieten. Dit kan de wortelhaarontwikkeling, de ontwikkeling van de laterale wortels en de elongatie van de hoofdwortel beïnvloeden. PGPR = plant growth promoting rhizobacteria Plantengroeibevordering door rhizobacteriën

Natuurlijke microflora van de rhizosfeer De pathogene micro-organismen Nematoden en schimmels Bacteriën De voor de mens pathogene micro-organismen Tijdens productie van voedselproducten Voor en tijdens het oogsten Binnen de pathogene micro-organismen zijn de twee grootste groepen de nematoden en de schimmels. Maar ook bacteriën kunnen pathogeen zijn voor planten. Soms kan er ook binnen een bepaald genus zowel pathogene als groeibevorderende stammen zijn, bijvoorbeeld bij het genus Pseudomonas. Pseudomonas syringae is een bekend pathogeen, terwijl Pseudomonas fluorescens groeibevorderend is.   De voor de mens pathogene micro-organismen komen voor tijdens de productie van voedselproducten. Dit kan gebeuren zowel na het oogsten en bereiden van voedsel als voor het oogsten. Dit gebeurt door contaminatie via water, zaden of dieren. Plantengroeibevordering door rhizobacteriën

Arabidopsis thaliana Zandraket Gebruik in onderzoek Klein genoom Snelle levenscyclus Gevoelig voor genetische transformatie Simpele foto Arabidopsis thaliana, ook zandraket genoemd, is een kleine plant waarvan veel informatie gekend is, zowel op genetisch als biologisch vlak. De reden waarom de plant zo vaak gebruikt wordt in onderzoek is omdat het een klein genoom heeft dat volledig gekend is. De plant heeft ook een snelle levenscyclus en is gevoelig voor genetische transformatie waarbij genen kunnen uitgeschakeld en ingebracht worden.   Het doel van het werken met Arabidopsis thaliana in dit onderzoek is het screenen van de kandidaat rhizobacteriën om een overzicht te verkrijgen van hoe de bacteriën reageren op de plant. Plantengroeibevordering door rhizobacteriën

Maïs Bestanddelen: Gebruik voor mens, dier en industrie Vitamine A, C en E Koolhydraten Mineralen 9% eiwitten Gebruik voor mens, dier en industrie Maïs is één van de meest gebruikte graansoorten in de wereld. De bestanddelen die aanwezig zijn in de granen zijn: vitamine A, C en E, koolhydraten, mineralen en 9% eiwitten. Hierdoor worden ze vaak gegeten door de mens, gebruikt in de industrie en gebruikt in veevoeder. Plantengroeibevordering door rhizobacteriën

Methodologie Opgroeien van de rhizobacteriën op verschillende media TSB (Tryptic Soy Broth) ATCC-2 GYM (Glucose, Yeast and Malt) In het onderzoek wordt begonnen met het opgroeien van de rhizobacteriën op een plaat met medium die zorgt voor een goede, snelle groei van de bacterie. Hierbij wordt eerst gekeken of de bacteriën op TSB-medium groeien. Dit gebeurt door de bacterie vanuit de stock op een plaat met TSB-medium te enten en in de oven bij 28°C te laten groeien. Daarna worden de bacteriën ook op ATCC-2 en GYM geënt op dezelfde manier. Plantengroeibevordering door rhizobacteriën

Methodologie Arabidopsis thaliana Sterilisatie van Arabidopsis zaden Vernalisatie van Arabidopsis zaden Opgroeien in de groeikamer Deze bacteriën worden dan gebruikt om te testen op Arabdiopsis thaliana. De zaden van Arabidopsis thaliana worden eerst gesteriliseerd door middel van gas sterilisatie. Daarna worden ze op een specifiek medium uitgestrooid. Dit specifiek medium is het Arabidopsis medium zonder suiker. Op die manier kunnen ze gevernaliseerd worden door ze twee dagen in een 4°C kamer te plaatsen, dit heeft als doel de kieming gelijk te krijgen. Na twee dagen vernaliseren worden de planten in de groeikamer geplaatst. Plantengroeibevordering door rhizobacteriën

Methodologie Arabidopsis thaliana Methode 1: Toevoegen van bacteriën aan het AM- medium Methode 2: Toevoegen van bacteriën op het AM- medium met een streepenting In de volgende twee methoden om de rhizobacteriën te testen op Arabidopsis thaliana worden telkens planten gebruikt die vier dagen in de groeikamer gegroeit hebben. In de eerste methode wordt er vertrokken van een vloeibare cultuur van de kandidaat bacterie. Vervolgens wordt de bacteriële oplossing voor gebruik op een optische densiteit van 0,02 gebracht. Van de bacteriële oplossing wordt een volume van 0,125 mL of 0,250 mL in het groeimedium voor de planten vermengd. Hierdoor is de bacterie verspreid over het volledige medium. De Arabidopsis planten worden overgezet van de op het groeimedium, zoals aangegeven op de figuur.   De tweede methode houdt in dat de kandidaat bacteriën rechtstreeks met een streepenting aangebracht worden op het Arabidopsis medium. Bij beide methoden worden telkens drie herhalingen uitgeoverd voor elke bacterie en er wordt altijd een blanco gebruikt ter controle. Om de platen met de bacterie te analyseren worden deze ingescand na tien dagen groei. Hierdoor kan de wortellengte bepaalt worden. Na 14 dagen worden ook metingen gedaan van het gewicht door zowel de wortel als de scheut te wegen. Methode 1 Methode 2 Plantengroeibevordering door rhizobacteriën

Methodologie Zea mays Sterilisatie van Zea mays zaden Inoculatie van Zea mays zaden Paper roll methode Na het testen van de rhizobacteriën op Arabidopsis worden dezelfde bacteriën getest op Zea mays. Er wordt gewerkt met Zea mays zaden die gebruikt worden in de landbouw. Deze zaden worden door een fungicide omgeven, om een betere kieming te verkrijgen door bescherming tegen schimmelinfecties. Dit is niet nodig in het dit onderzoek, daarom wordt de funigicide weggespoeld en de maïs zaden gesteriliseerd. Het steriliseren van de zaden gebeurd door middel van spoeling met water, ethanol 70% en een bleekmiddeloplossing.   Voor de inoculatie van de maïs zaden wordt net zoals bij de eerste methode van Arabidopsis vertrokken van een vloeibare cultuur van de kanidaat bacterie. De bacteriële oplossing wordt ook op een optische densiteit van 0,02 gebracht. Deze oplossing kan dan in een erlenmeyer gebracht worden waaraan de maïs zaden toegevoegd worden. Dit wordt dan op een shaker gezet voor twee tot drie uur. De paper roll methode die gebruikt wordt gaat als volgt, de met bacteriën geïnoculeerde maïs zaden worden tussen papier gelegd zoals te zien op de linkse figuur. Daarna wordt alles opgerold in een paper roll. Dit wordt in een steriele buis gestoken, dit is te zien op de rechtse figuur. De zaden groeien voor acht dagen, waarna ze geanalyseerd worden op lengte, het gewicht van de wortel en het gewicht van de scheut. Plantengroeibevordering door rhizobacteriën

Resultaten Optimalisatie van het opgroeien van de bacteriën op verschillende media TSB (Tryptic Soy Broth) Bovenlimiet drie dagen 64/127 bacteriën ATCC-2 GYM (Glucose, Yeast and Malt)  Alle bacteriën werden eerst opgegroeid op agar-platen met TSB-medium. Van de in totaal 127 bacteriën, zijn er in totaal 64 bacteriën die binnen de drie dagen groei vertonen op dit medium. De bacteriën die niet binnen de drie dagen opgroeiden, werden op ATCC-2 medium gegroeid. Dit medium is het medium waarin de bacteriën werden opgegroeid voor deze ontvangen werden. Het is een medium specifiek voor twee soorten bacteriën, namelijk het genus Micromonospora en Streptomyces. Dit omdat de meeste van de bacteriën die niet willen groeien op het TSB medium zijn van het genus Micromonospora en Streptomyces. Alle bacteriën groeien ongeveer even goed op beide media en geen enkele bacterie groeide alleen op het ATCC-2 medium, waardoor besloten werd het ATCC-2 medium niet te gebruiken. Het gebruiken van verschillende media heeft weinig effect op het opgroeien van bacteriën. Andere factoren kunnen eventueel aangepast worden, zoals bijvoorbeeld de temperatuur.   Een ander medium die gebruikt werd is GYM, dit medium is specifiek bedoeld om Streptomyces op te groeien. Dit medium had hetzelfde resultaat als bij het ATCC-2. Uiteindelijk wordt er enkel verder gewerkt met de bacteriën die binnen de drie dagen kunnen opgroeien op TSB-medium. Plantengroeibevordering door rhizobacteriën

Resultaten Arabidopsis thaliana Bacterie CA-246095, die de grootste procentuele toename in Arabidopsis veroorzaakt in de eerste methode Bacterie CA-246134, die de grootste procentuele afname in Arabidopsis veroorzaakt in de eerste methode Van alle 54 bacteriën die getest zijn geweest op Arabidopsis vertoont bacterie CA-246095 de grootste procentuele toename in het gewicht van de wortel en de scheut bij de eerste methode. Het wortelgewicht heeft een procentuele toename van 60% en het scheutgewicht heeft een procentuele toename van 96%. Bacterie CA-246134 heeft de grootste procentuele afname in het gewicht van de wortel en de scheut bij de eerste methode. Het wortelgewicht heeft een procentuele afname van 62% en het scheutgewicht heeft een procentuele afname van 54%. Plantengroeibevordering door rhizobacteriën

Resultaten Arabidopsis thaliana Wortel Wortel Scheut Scheut Wortel en scheut vernoemen In de volgende grafiek is te zien dat bacterie CA-246095 voor zowel het gewicht van de wortel als de scheut een significante toename heeft ten opzichte van de blanco. Bij bacterie CA-246134 toont een duidelijke daling in het gewicht van de wortel en de scheut ten opzichte van de blanco. Plantengroeibevordering door rhizobacteriën

Resultaten Arabidopsis thaliana Bacterie CB-269115, die geen effect in Arabidopsis veroorzaakt in de eerste methode Bacterie CA-251940, die de grootste procentuele afname in Arabidopsis veroorzaakt in de tweede methode Bacterie CB-269115 is een voorbeeld van een bacterie die geen effect heeft op het gewicht van de wortel en de scheut in de eerste methode. Bacterie CA-251940 is een voorbeeld van een bacterie die een negatief effect vertoont op het gewicht van de wortel en de scheut. Plantengroeibevordering door rhizobacteriën

Resultaten Arabidopsis thaliana 38/54 bacteriën die een positief effect verkrijgen in één van de twee methoden 28 bacteriën positief effect in de eerste methode Tien bacteriën positief effect in de tweede methode Eerste methode: 23 bacteriën positief effect voor wortel- en scheutgroei  drie enkel wortel en twee enkel scheut Tweede methode: Acht bacteriën positief effect voor wortel- en scheutgroei  twee enkel wortel en geen enkel scheut In totaal zijn er 38 bacteriën op een totaal van 54 geteste bacteriën die in één van beide methoden plantegroei positief beïnvloeden. Bij de eerste inoculatiemethode zijn er 32 bacteriën die plantengroei positief beïnvloeden, terwijl bij de streepenting er maar tien bacteriën plantengroei positief beïnvloeden.   23 bacteriën in de eerste inoculatiemethode stimuleren zowel wortel- als scheutgroei, terwijl slechts drie alleen wortel- en één alleen scheutgroei stimuleren. Acht bacteriën in de tweede streepenting methode stimuleren wortel- en scheutgroei, terwijl slechts twee alleen wortelgroei stimuleren en geen enkele bacterie alleen scheutgroei stimuleert. Plantengroeibevordering door rhizobacteriën

Resultaten Arabidopsis thaliana Correlatie tussen de twee methoden  4 positief effect in beide methoden Correlatie tussen de twee densiteiten  13 positief effect in beide densiteiten Als beide inoculatie methoden met elkaar vergeleken worden, valt er op dat slechts vier bacteriën groei stimuleren in beide methoden. Er is een groot onderscheid tussen de resultaten van de twee verschillende methoden bij de Arabidopsis testen. De reden hiervoor is dat bij de eerste methode de planten onmiddellijk in contact gebracht worden met de bacteriën en bij de tweede methode is er maar contact wanneer de wortel van de plant tot aan de streep met bacterie gegroeid is.   De meeste bacteriën tonen in de twee verschillende densiteiten een positief effect, dit zijn in totaal 13 bacteriën. Het gebruik van de twee verschillende densiteiten aan bacteriën in de eeste methode geeft verschillende effecten voor verschillende bacteriën. Er zijn gevallen waarbij enkel de 125 µL of de 250 µL voor positieve effecten zorgt. Maar de meeste gevallen hebben positieve effecten op beide densiteiten. Er is ook op te merken dat er in vele gevallen het gewicht van de wortel en de scheut beide gestimuleerd worden. Plantengroeibevordering door rhizobacteriën

Resultaten Zea mays Er zijn geen significante toenames of afnames in het gewicht van de wortel en de scheut bij de paper roll methode met de Zea mays. In totaal zijn er slechts vier gevallen waarbij de Arabidopsis resultaten overeenkomen met die van de maïs resultaten. Plantengroeibevordering door rhizobacteriën

Conclusie Verdere optimalisatie van de groei van de bacteriën is mogelijk Arabidopsis test vertoont vele rhizobacteriën die plantengroei bevorderen Zea mays test vertoont geen significante toenames in plantengroei Meer rhizobacteriën moeten gescreend worden op maïs De groei van de collectie bacteriën kan nog verder geoptimaliseerd worden, zodat er meer bacteriën kunnen gebruikt worden in de screening.   In de tests met Arabidopsis thaliana zijn er veel kandidaat rhizobacteriën die de plantengroei bevorderen. De beste methode om dit te doen is de eerste methode, waarbij de bacteriën aan het medium toegevoegd worden. Bij de tests met Zea mays zijn er geen significante toenames in plantengroei waar te nemen. Er zullen meer rhizobacteriën gescreend moeten worden om verdere conclusies te kunnen trekken. Plantengroeibevordering door rhizobacteriën

Plantengroeibevordering door rhizobacteriën Tibby Deckers Bachelor in Farmaceutische en Biologische laboratoriumtechnologie VIB Department of Plant System Biology Vragen?