Validatie Factor II mutatie en Factor V Leiden met GeneXpert Amber Vanhaecke Onder begeleiding van Dr. E. Moreau en A. Cottyn Eerst en vooral wil ik u bedanken voor hier aanwezig te zijn. Sommigen onder jullie zullen wel eens gehoord hebben over het toestel GeneXpert. Maar voor andere zal er een andere wereld opengaan. Mijn bachelorproefonderwerp is de validatie van fII mutatie en FVLeiden met GeneXpert. 2015-2016

AZ Delta 3 ziekenhuiscampussen Centraal labo: Ardolab Hematologie Wilgenstraat Brugsessteenweg Menen Centraal labo: Ardolab Hematologie Labo moleculaire diagnostiek (LMD) Ik ben Amber Vanhaecke, 3de jaars student MLT. Ik heb de kans gehad om mijn stage te lopen in Ardolab, een labo van AZ Delta. AZ Delta is een fusie van verschillende ziekenhuizen. Zo zijn er 3 campussen SATR is het vroegere Heilighart ziekenhuis Roeselare. Er is ook een tweede campus in Roeselare SATS, Het stedelijk ziekenhuis. De derde campus ligt in Menen. Ik ben zeer tevreden dat mijn bachelorproef in de hematologie was. Ik ben van kleins af aan geïnteresseerd in de mens. Zo was er vroeger het programma het leven zoals het is de mens, de rode mannekes die zuurstof rondbracht in het lichaam, dit programma kreeg al mijn aandacht. Ik heb dan ook iets langer dan andere stagiairs in LMD gezeten. Want de GeneXpert kan men vergelijken met allemaal verschillende PCR toestellen. En waar beter te leren dan in het labo moleculaire diagnostiek. 2015-2016

Inhoudsopgave Literatuurstudie Methodologie Resultaten Discussie Conclusie 2015-2016

Bloedstolling Primaire bloedstolling Secundaire bloedstolling VWF Intrinsiek systeem Extrinsiek systeem Common pathway FII FV De bloedstolling bestaat uit de primaire en secundaire bloedstolling. De primaire bloedstolling zorgt voor een vasoconstrictie van de bloedvaten. Door de vermindering van het stromend bloed kunnen de thrombocyten en stollingsfactoren hun werk doen. Von willebrandt zal zich ontrollen en de thrombocyten zullen zich vasthechten en actief worden. De geactiveerde thrombocyten scheiden stoffen af om andere thrombocyten te activeren. Tegelijkertijd met de aggregatie van de thrombocyten zal de secundaire bloedstolling starten. Hierbij komt het bloed in contact met weefselfactor. Weefselfactor activeert de plasma stollingsfactoren. Na enkele reacties wordt er een fibrinenetwerk gecreëerd om het thrombocytenagregaat te verstevigen. Dit gebeurd allemaal via verschillende pathways. De intrinsieke, extrinsieke en common pathway. De Intrinsieke pathway start met oppervlakte contact en de extrinsieke met weefselschade. Deze twee pathways komen dan samen met de start van de common pathway. een mutatie verhoogt de thromboseneiging 2015-2016

Factor II FII wordt FIIa: fibrinogeen  fibrine FI vormt de klonter (fibrine) V met X complex zorgt dat FII wordt geactiveerd VII activeerd X XIII Hecht fibrinedraden stevig vast aan elkaar Proteïne C splitst FV en remt de stolling? Bp voor aggregaat 2015-2016

Primaire bloedstolling Vasoconstrictie (stroming bloed↓) Thrombocyten en collageen binden door VWF Flipflop-reactie thrombocyten 2015-2016

Intrinsieke pathway Start bij FXII  bindt bij negatief geladen opp 2015-2016

Extrinsieke pathway Weefselfactor 2015-2016

Common pathway 2015-2016

Factor II mutatie [Prothrombine]↑↑ Stollingssysteem = actiever Opsporen: G20210A Thrombofilie Relatief verhoogd thrombose-risico FII mutatie Heterozygoot: 5 Homozygoot: 80 Factor II mutatie leidt tot een verhoogde concentratie van prothrombine. Door deze verhoging is het stollingsysteem actiever en moeilijker te remmen De prothrombinevariant (G20210A) wordt opgespoord met een moleculaire test namelijk PCR. PCR heeft tot doel te detecteren of een patiënt een puntmutatie heeft in het in het 3’ einde van het prothrombine gen (FII). (Protrombinevariant, 2016) De mogelijke resultaten zijn dat de patiënt geen, heterozygote of homozygote drager is. Als er uit DNA onderzoek gebleken dat deze patiënt geen drager is van het protrombine mutatie G20210A dan heeft de patiënt geen verhoogd risico op veneuze thrombo-embolie ten gevolge van deze mutatie. Als de drager heterozygoot of homozygoot is voor deze mutatie, dan heeft die patiënt een verhoogd risico op veneuze thrombo-embolie. 2015-2016

Factor V Normaal FV gesplitst door APC  Stolling remmen Complex met FX (prothrombine activator) prothrombine activator : Binnen seconden splitst dit complex prothrombine tot thrombine. 2015-2016

Factor V Leiden Thrombofilie Relatief verhoogd thrombose-risico APC-resistentie Heterozygoot: 5 Homozygoot: 80 FV Leiden is een puntmutatie waarbij het aminozuur arginine vervangen wordt door een glutamine residu. Door deze mutatie is de plaats waar factor V normaal wordt gesplitst veranderd. Daardoor kan geactiveerd proteine C (APC) niet gemakkelijk binden met FV. De stolling wordt trager afgeremd. Hierdoor is het evenwicht van het stollingssysteem verschoven in de richting van een duidelijke toename van de stolling. Met andere woorden is Factor V Leiden resistent tegen de splitsing door APC. Daarom spreekt men ook wel van ‘APC-resistentie’   Ook hier zijn de mogelijke resultaten dat de patiënt geen, heterozygote of homozygote drager is. Als er uit DNA onderzoek gebleken dat deze patiënt geen drager is van FV Leiden dan heeft de patiënt geen verhoogd risico op veneuze thrombo-embolie ten gevolge van deze mutatie. Als de drager heterozygoot of homozygoot is voor deze mutatie, dan heeft die patiënt een verhoogd risico op veneuze thrombo-embolie. Er zijn ook extra risico’s, zoals in het bijzonder bij het innemen van oestrogenen in tabletvorm of tijdens de zwangerschap. Zo hebben heterozygote draagsters, die de pil gebruiken een 35 maal verhoogd risico. Andere situaties die het risico vergroten zijn operaties, langdurige bedlegerigheid (immobilisatie), verband om de benen 2015-2016

Aminozuren 2015-2016

PCR Matrijs: enkelstrengige templaten na denaturatie dubbele DNA-helix Primers Polymerase Nucleotiden Proces T↑ (94 °C): waterstofbruggen breken  templaat-vorm T↓ om primers te laten binden op templaat T↑ (72°C): optimale T voor polymerasen. 2015-2016

Real-time PCR Amplificatie DNA waargenomen tijdens PCR TaqMan probe: Detectie en kwantificering fluorescerende labels (reporters) Gemeten voordat PCR plateaufase bereikt Omdat beide methodes berusten op het principe van Real-Time PCR zal ik eerst wat uitleg geven. Elk staal bereikt na een verschillend aantal cycli een bepaalde hoeveelheid fluorescentie. De cycle treshold (of Ct) is het aantal cycli die nodig zijn om die hoeveelheid fluorescentie te bereiken (Figuur 5.23). Het meten van het detectiesignaal vindt continu tijdens de DNA-synthese plaats. 2015-2016

LMD: TaqMan probe Assay Legende 2. Denatured Template And Annealing Assay Components 1. Assay Components and DNA Template 3. Polymerization and Signal Generation Vic Dye Fam Dye Reversed primer probe probe Quencher Forward primer Reversed primer Probe Reversed primer Minor groove binder Probe Probe Polymerase DNA Template Forward primer Forward primer Probe In LMD eerst DNA isolatie en dan pas realtime pcr. Dit betekend dat men het fluorescent signaal zal zien stijgen tijdens de verschillende stappen van de pcr Dit zijn alle componenten om de TaqMan probe Assay te doen slagen. De assay bevat twee primers om de gewenste sequentie te bekomen. Er zijn ook twee TaqMan probes aanwezig waardoor twee verschillende allelen kunnen worden opgespoord met 1 reactiemengsel. De taqman probe bevat aan de 5’ kant een reporter VIC of FAM en aan de 3’kant een quencher. Zolang deze twee samen zijn, zal er geen fluorescentie ontstaan. Wanneer een probe wordt ingebouwd wordt de reporter vrij gegeven en zal de reporter fluorochroom licht geven na bestraling met een laserlicht. Afhankelijk van welk lichtsignaal kan men nagaan of de persoon normaal, heterozygoot of homozygoot is voor deze mutatie. (vic=nrml; fam=gemuteerd) Primer Template Extended primer Match 2015-2016

DNA Purines: adenine en guanine Pyrimidines cytosine en thymine > N-atomen om H+ op te nemen  basisch karakter Fosfaatgroepen (negatieve lading) 2015-2016

GeneXpert Real-time PCR Volbloed Cartridge, module en I-core De GeneXpert is een toestel die werkt met het principe van real-time PCR. Het toestel kan gebruikt worden voor verschillende testen zoals MRSA, Clostridium difficile, chlamydia… Maar hier werd er gekozen voor FII en FV mutaties. Het toestel zit simpel in elkaar. Hier ziet u de genexpert met 16 verschillende modules. Deze modules kunnen apart van elkaar functioneren. Het enige dat nog ontbreekt is de cartridge. 2015-2016

GeneXpert https://www.youtube.com/watch?v=mIsBLmjus6Q Filmpje https://www.youtube.com/watch?v=mIsBLmjus6Q Firma cepheid De cartridge is gemaakt uit 4 specifieke delen: de cartridge body, de valve (….), de onderkant en het deksel. Eerst moet je het staal in het staalgedeelte pipeteren, daarna het deksel sluiten en in een lege module plaatsen. Als het toestel zal een plunger in de cartridge plaatsen die bestuurd wordt door de valve. Zo word het staal in het centrale deel opgenomen. De valve zal draaien naar positie 2. de organismen blijven kleven aan een filter in het actief gedeelte, de rest van het staal wordt verwijderd. Daarna draait de valve body naar positie 3 en het eerste reagentia gaat in het centraal gedeelte en loopt dan door het actief gedeelte. Daarna draait de valve naar positie 4 en doet juist hetzelfde maar dan met het tweede reagentia. Op dit moment komt er een sonische hoorn tegen de valve body. Deze ultrasonisch… breekt de organismen en zo verkrijgen we het genetisch materiaal. Het genetisch materiaal gaat dan naar een kamer met de eerste twee beads. Dan gaat het over naar positie 5 waarbij de oplossing door de reactiekamer gaat. Daarna gaat de oplossing naar de volgende kamer met de andere beads. En gaat het staal terug naar de reactiekamer voor thermocycling. Nu zien we hier 6 detectoren en na deze stap is het experiment uitgevoerd 2015-2016

GeneXpert: I-core De I-core is eigenlijk de reactiekamer van de module. De Ledjes zullen de fluorescentie fluorochromen exicteren emissie. In de reactiekamer zijn er ook spiegels aanwezig om het signaal te versterken. De emissie zal worden gedetecteerd door de verschillende detectoren. 2015-2016

Vb van bekomen resultaten. Langer bij stil staan X-as is het aantal cycles en de y-as staat voor de fluorescentie. Tijdens de eerste cycles kan men nog geen fluorescentie waarnemen. Maar aan een bepaald aantal cycli is er fluoresentie waarneembaar. Deze drempel wordt de cycle threshold genoemt. Daarna zien we de fluorescentie nog stijgen met het aantal cycli tot er een plateauniveau wordt bereikt. Hier zien we de resultaten van de 2 factoren (FII en FV) we zien 4 fluorescentiesignalen omdat het resultaat van de normale en gemuteerde genen aanwezig zijn. 2015-2016

Resultaten Juistheid Staaltype Reproduceerbaarheid Houdbaarheid Prijsberekening 2015-2016

Resultaten: juistheid Staal LMD GeneXpert 16 894 Normaal 07 538 He FV 26 772 35 598 24 705 37 208 05 213 He FII Vrijwilliger 2 12 835 17 489 He FII en He FV Vrijwilliger 1 22 787 16 840 IC-063 Ho FV 3 normale stalen 3 He FII 5 He FV 2 HE HE 1 HO FV Geen Ho FII te oud staal. 2015-2016

Resultaten: staaltype Citraat EDTA 2015-2016

Resultaten: reproduceerbaarheid Staal Module A1 Module A2 Module A3 Module A4 16 894 Normaal Vrijwilliger 1 (EDTA) Heterozygoot FII Vrijwilliger 1 (citraat) Vrijwilliger 2 (EDTA) Heterozygoot FV Vrijwilliger 2 (citraat) 2015-2016

Resultaten: houdbaarheid Staal Vers (< 24h) Na 3 dagen Na 9 dagen Na 1 maand (6 °C) Vrijwilliger 1 (EDTA) Heterozygoot FII Vrijwilliger 1 (citraat) Vrijwilliger 2 (EDTA) Heterozygoot FV Vrijwilliger 2 (citraat) 2015-2016

Resultaten: prijsberekening Toestel GeneXpert LMD Hands-on-time Verwaarloosbaar   Ongeveer 2 uur/15 stalenéz Kostprijs reagentia 45 euro 12,59 euro Totale prijs 20,13 euro  LMD is het goedkoopste methode 2015-2016

Conclusie  AZ Delta blijft bij de TaqMan probe Assay methode Eenvoudig Snel Verlengde houdbaarheid EDTA en citraat Juistheid en reproduceerbaarheid 100% Duur  AZ Delta blijft bij de TaqMan probe Assay methode 2015-2016