Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Confocal Laser Scanning Microscopy.

Presentatie over: "Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Confocal Laser Scanning Microscopy."— Transcript van de presentatie:

1 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Confocal Laser Scanning Microscopy dept. of Pathology, Ghent University CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

2 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) basic confocal fluorescent microscopy CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

3 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Conventional widefield fluorescent microscope: Fluorophores throughout the entire depth of the specimen are illuminated Fluorescence signals are collected not only from the plane of focus but also from areas above and below  Thick specimens: blurry, lack of contrast CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

4 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Confocal fluorescent microscope: Point light source: intense irradiation at the focal spot Point detection: elimination of out-of-focus fluorescence  Optical sectioning of thick specimens: sharp images CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

5 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) widefieldversuspoint illumination CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

6 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Benefits of CLSM: Elimination of out-of-focus fluorescence Areas above and below the focal spot: less intense irradiation Series of optical sections at different depths: 3D reconstruction of the specimen CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

7 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Benefits of CLSM: Permits the direct study of living cells without damage Improves lateral and axial resolution Simultaneous detection Electronic data acquisition CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

8 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

9 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Elements of the confocal microscope: Point light source (laser) Scanning system (usually a laser-scanner) Lens (condensor and objective) Filters Detector (PMT or CCD) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

10 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

11 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Applications: Fluorescent-stained cells in tissue slices/small intact organisms Localizing fluorescence-tagged molecules in dissociated cells Monitoring fluorescence in living specimens (GFP) Photobleach experiments (FRAP, FLIP) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

12 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Radiance 2100 CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

13 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

14 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) System: Nikon Diaphot 300 Inverted microscope Lenses: 10x fluor, 40x fluor (oil), 60x plan apo (oil) Hg lamp Filter sets: DAPI, FITC, TRITC CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

15 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) System: 3 lasers 4 line argon laser: 457, 476, 488, 514nm Green HeNe laser: 543nm Blue laser diode: 405nm 2 channel confocal CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

16 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) System: dichroic mirrors 100% det1 500DCLPXR 560DCLPXR 100% det2 CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

17 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) System: PMT1 emission filter set  HQ442/45  HQ500LP  HQ485/30  HQ515/30  HQ488/10  HQ530/60 CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

18 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) System: PMT2 emission filter set  HQ515/30  HQ590/70  HQ530/60  HQ600/50  HQ545/40  E600LP  E570LP CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

19 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) System: implications for the choice of fluorophore Lasers  absorption spectrum Emission filters  emission spectrum Fluorophore wall chart BioRad interactive database at http://fluorescence.bio-rad.com/frames6.htm CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

20 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

21 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

22 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

23 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

24 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Software: Lasersharp 2000 Instrument control panel Objective Box size Speed Channel CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

25 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Software: Lasersharp 2000 Control of the optical system set up Laser Dichroic mirror Emission filter  Method design (simultaneous/sequential) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

26 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

27 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

28 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Lasersharp 2000: image acquisition Live scan/sequential live scan Z-series collection Vertical section Line scan Scan rotation and panning CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

29 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

30 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Lasersharp 2000: analysis and processing functions Arithmetic operations Histogram Line profile Projection Orthogonal view CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

31 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

32 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

33 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

34 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

35 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Lasersharp 2000: region of interest scanning (ROI) Fotobleaching experiments (FRAP, FRET, …) Different shapes of ROIs Different illumination levels Multi-phase time course CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie

36 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

37 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

38 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Images

39 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

40 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

41 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

42 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

43 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

44 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel)

45 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie monolayer culture of cervical cancer cells Van Herreweghe et al, Antiviral Research 2006

46 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie monolayer of cervical cancer cells in coculture with PBMCs Van Herreweghe et al, Antiviral Research 2006

47 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie monolayer of cervical cancer cells infected with fluorescent beads Van Herreweghe et al, Antiviral Research 2006

48 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Raedt et al 2008 Survival and dispersion of transplanted BrdU/GFP positive aNPCs.

49 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Raedt et al 2008 in vivo differentiation towards GFAP positive astrocytes

50 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Raedt et al 2008 In vivo differentiation towards NeuN positive neuronal cells

51 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Waeytens et al, IBD 2008 thick sections from ileum (A-C) and colon (D-F) from IL-10 -/- mice that received L. lactis intragastrically

52 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Waeytens et al, IBD 2008 Transmission electron micrographs of intact mucosa from loops in control mice (A, B)

53 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Waeytens et al, IBD 2008 Transmission electron micrographs of inflamed mucosa originating from ileal loops in DSS-Balb/c mice (C- E) and IL-10 -/- mice (F).

54 Naam presentatie – Naam maker en/of presentator - 12/09/2005 Faculteit Naam Faculteit – Dienst of Vakgroep (optioneel) Practical information Assistance: Anouk Waeytens, Isabelle Rottiers Demo + CAS software Reservation online Image storage: CD, DVD, USB, … Handbooks CLSM – Anouk Waeytens – 18/12/2006 Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen – Vakgroep Pathologische Anatomie