Presentatie titel Rotterdam, 00 januari 2007 GKL11 Cursus genklonering Rotterdam, september 2008.

Presentatie over: "Presentatie titel Rotterdam, 00 januari 2007 GKL11 Cursus genklonering Rotterdam, september 2008."— Transcript van de presentatie:

1 Presentatie titel Rotterdam, 00 januari 2007 GKL11 Cursus genklonering Rotterdam, september 2008

2 Aanleiding

3 Algemeen kloneerschema (voorbeeld)

4 Meer kloneerschema’s http://www.google.nl/

5 Stappenplan voor één kloneerstap 1.Isolatie methode kiezen: PCR ! 2.Vector kiezen 3.Gastheerstam kiezen 4.Transformatietechniek kiezen 5.Selectiemethode kiezen 6.Hoe bewijs je dat correcte construct is gemaakt? 7.Maak een stroomdiagram

6 Lesmateriaal  New England Biolabs catalogus New England Biolabs catalogus  Promega Subcloning notebook Promega Subcloning notebook

7 Welk deel van het gen heb je nodig? Gen tot expressie brengen: Open reading frame (ORF) DNA als probe gebruiken: ORF(fragment) of genomisch DNA (fragment)

8 Welk materiaal (bron) bevat je gen ? Promoter: genomisch DNA Intronen: genomisch DNA ORF: cDNA uit mRNA van cellen waarin het gen tot expressie komt

9 Welke isolatietechniek ga je gebruiken? 1.Directe restrictie/ligatie (genenbank)  Nadeel: Omslachtig  Voordeel: Geen mutaties 2.Amplificatie met behulp van PCR-primers blunt-ligering TA-cloning ingebouwde restrictiesites ingebouwde recombinatiesequenties  Voordeel: Snel  Nadeel: Mutatiegevoelig dus extra controle achteraf nodig

10 Waar vind je informatie over een gen? http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pubmed

11 Hoe ontwerp je een primer? http://eu.idtdna.com/home/home.aspx

12 Een PCR product …. En dan? Digestie …aan een uiteinde …in welke buffer? …met twee enzymen tegelijk Star activity

13 Alternatieven voor restrictie/ligatie cloning TA cloning Promega subcloning notebook p 35 Recombinatie cloning

14 Deelopdracht 1 1. Ontwerp een primerset voor de amplificatie van een gen naar keuze dat blunt in een expressievector moet worden gekloneerd. 2. Laat in een rapport zien: 1. Het gekozen gen (waar codeert het voor?) 2. De sequentie die je template wordt 3. De primersequenties 4. De analyses van de mogelijk primers en sets 5. De set die jij geschikt vindt Inleveren digitaal uiterlijk eerstvolgende les