Biologische Labcourse Nanobiologie NB1061 deel 2   Basistechnieken Microscopie, Microbiologie en Moleculaire Biologie Week 9  

Presentatie over: "Biologische Labcourse Nanobiologie NB1061 deel 2   Basistechnieken Microscopie, Microbiologie en Moleculaire Biologie Week 9  "— Transcript van de presentatie:

1 Biologische Labcourse Nanobiologie NB1061 deel 2   Basistechnieken Microscopie, Microbiologie en Moleculaire Biologie Week 9  

2 Welke insertie zit er in het plasmide??
Hind III Faag lambda DNA Hind III Hind III Bam HI EcoRI Hind III

3 pUC 18 plasmide Hoe ga je aantonen dat er een insertie in
Wij hebben het artificiële pUC 18 plasmide gebruikt Het bevat een ORI en een resistentiegen Er is in een unieke restrictie site gekloneerd, nl. de Hind III site Unieke sites zitten in de MCS (multi-cloning site) in de polylinker Hoe ga je aantonen dat er een insertie in jouw pUC 18 plasmide zit? En hoe groot die insertie is??

4 Knippen (digesteren) van het plasmide
Waarmee ga je het plasmide knippen? Hoe weet je dat het plasmide geknipt is? Welke controle neem je mee? Hoe bepaal je de lengte van de DNA fragmenten?

5 Opbrengen DNA in een agarosegel
Opbrengen DNA in een agarosegel Er wordt daarom “opbrengbuffer” aan het DNA toegevoegd; bv. een 5x buffer. Wat zit er in de opbrengbuffer? 10 ul plasmide DNA 10 ul Milli Q 5 ul 5x opbrengbuffer

6 Hoe weet je nu dat de electroforese lang genoeg heeft geduurd?
Je wilt zo kort mogelijk electroforeren, maar ook een zo groot mogelijke scheiding, kortom een duidelijk resultaat. Door aan het DNA monster een opbrengbuffer met een kleurstof toe te voegen kan je het electroforeseproces volgen Bij deze electroforese is de kleurstoffen BFB gebruikt. Deze migreert net zo snel als …………bp.

7 Geknipt faag lambda DNA
Het complete digestiepatroon van faag lambda geknipt met Hind III (A) Het patroon dat we meestal zien in agarosegels. (B) Agarosegel electroforese B A

8 Experimenten van week 6 Recombinant plasmide nr. 7
Recombinant plasmide nr. 7 1: Vergelijk de twee ongeknipte plasmiden met elkaar (ln 2 en 3) 2: Is pUC geknipt? Vergelijk laan 2 met 7. 3:Klopt de lengte van geknipte pUC met de Marker en met geknipte faag λ

9 Experimenten van week 6 Recombinant plasmide nr. 7
Experimenten van week 6 Recombinant plasmide nr. 7 1: Vergelijk de twee ongeknipte plasmiden met elkaar (ln 2 en 3) 2: Is pUC geknipt? Vergelijk laan 2 met 7. 3:Klopt de lengte van geknipte pUC met de Marker en met geknipte faag λ 4: vergelijk 7H (laan 5) met laan 7. Is er een insertie ? 5: Laan 6: Je kan de oriëntatie bepalen van het gekloneerde fragment EcoRI EcoRI

10 Het denatureren van het DNA gebeurt bij
Het denatureren van het DNA gebeurt bij ± 94 °C, 20 – 30 seconden is vaak al genoeg. De primer annealing vindt meestal plaats bij een temperatuur die tussen de 50 en 60 °C inligt ( De synthese vindt plaats bij 72 °C. De tijdsduur is afhankelijk van de lengte van het te synthetiseren DNA.

11 Waar hechten de primers op pUC18 voor de PCR???
PCR product op pUC = 139 bp Hoe groot is het PCR product op pUC 18? 364 forward primer 5’ 5’ 502 reversed primer

12 Experimenten van week 6 Recombinant plasmide nr. 7
Recombinant plasmide nr. 7 1: Vergelijk de twee ongeknipte plasmiden met elkaar (ln 2 en 3) 2: Is pUC geknipt? Vergelijk laan 2 met 7. 3:Klopt de lengte van geknipte pUC met de Marker en met geknipte faag λ 4: vergelijk 7H (laan 5) met laan 7. Is er een insertie ? 5: Laan 6: Je kan de oriëntatie bepalen van het gekloneerde fragment 6: laan 10 is PCR product op pUC 7: laan 9 = PCR product op recombinant plasmide 8: laan 11 = PCR van H2O

13 Experimenten van week 6 Recombinant plasmide nr. 1
Experimenten van week 6 Recombinant plasmide nr. 1 Enkele gegevens van de 2-Log DNA Ladder (0.1–10.0 kb). EcoRI heeft niet alles geknipt!!!!!! Vergelijk laan 3 met 5. De pijl geeft het geknipte bandje aan

14 Recombinant plasmide nr. 2
De ongeknipte plasmiden staan niet op de foto. Ook hier heeft EcoRI niet alles geknipt!!!!!! De pijl geeft het geknipte bandje aan

15 Recombinant plasmide nr. 8

16 Voorbeeld toets vragen
Een agarplaat (doorsnede = 8,5 cm) heeft 57 minuten opengestaan. Bereken het kiemgetal van deze ruimte. Welke eenheden gebruik je? Welk PCR apparaat heb je gebruikt? Met het 40 x objectief is een wangslijmvlies cel 28 oculairdelen breed. Hoeveel um is dat?? Lactobacillus kleurt ………………….. met de gram kleuring en is dus een gram ………. bacterie Noem 3 redenen waarom opbreng buffer aan een DNA monster wordt toegevoegd. Beschrijf zo nauwkeurig mogelijk de relatie tussen het open of dicht draaien van het diafragma en de scherpte-diepte (denk bv. aan het 2-haren exp.) Het enzym EcoRI herkent de volgende ds DNA sequentie: …………………………………… Schrijf ook de DNA sequentie op na de knip