Micro-array analyse.

Presentatie over: "Micro-array analyse."— Transcript van de presentatie:

1 Micro-array analyse

2 Micro-array Omdat het om expressie van genen gaat wordt:
M.b.v. de Micro-array techniek kan de activiteit van duizenden genen tegelijk bestudeerd worden Het gaat daarbij altijd om een vergelijking van minimaal 2 situaties; bv. een gewone cel en een tumorcel of hoe een cel of bacterie reageert op een bepaalde stof Omdat het om expressie van genen gaat wordt: mRNA uit de te bestuderen cellen geisoleerd. Hierop wordt gelabeld cDNA gemaakt Hybridisatie uitgevoerd met duizenden oligo’s tegelijk!!!! Mbv laserlicht wordt de hybridisatie bekeken

3 Micro-array of cDNA

4 Het maken van een micro-array
Het aanbrengen van het DNA op het glasplaatje gebeurt met een robot

5 Het principe van de methode

6 Een voorbeeld van een micro-array-analyse na hybridisatie
Als alleen het groene cDNA hybridiseerd licht dat spotje groen op Als alleen het andere cDNA hybridiseerd licht dat spotje alleen rood op Hybridiseren beide cDNAs aan hetzelfde spotje dan wordt het een mengkleur, bv. geel. Op deze manier is de activiteit van genen zichtbaar te maken Het wordt bv. toegepast om de activiteit van genen bij borsttumoren in kaart te brengen.

7 PCR varianten Nested PCR Multiplex PCR RT-PCR Real time PCR

8 Nested PCR Bij nested PCR wordt na een gewone PCR met twee primers een tweede PCR uitgevoerd op een monster van het 1ste PCR mengsel. Er worden dan nieuwe primers gebruikt die binnen de 1ste primerset vallen; vandaar het woord “nested”.

9 Nested PCR Door nested PCR verhoog je de specificiteit van de reactie en de gevoeligheid. A-specifieke producten uit de 1ste PCR zullen door de tweede PCR niet verder worden vermenigvuldigd.

10 Multiplex PCR Multiplex PCR is een PCR waarbij meerdere primersets tegelijk worden gebruikt om meerdere DNA sequenties tegelijk specifiek te produceren. Een voorbeeld hiervan is bv. een RAPD analyse RAPD = random amplified polymorfic DNA

11 RAPD Er wordt 1 korte primer (8 – 12 nt) gebruikt.
De afstand tussen 1 en 4 is te lang om een product op te leveren. De RAPD analyse kan gebruikt worden om verschillen tussen personen aan te tonen.

12 RT-PCR RT-PCR = reverse transcriptase PCR = PCR op RNA
Het RNA moet eerst worden omgezet in cDNA. Dit kan bv. in 45’ bij 45 °C. Daarna kan de PCR reactie plaatsvinden. s = sense primer as = antisense primer

13 RT-PCR Het Reverse Transcriptase heeft net als alle andere DNA polymerases een primer nodig om te starten. Voor eukaryotisch mRNA is die primer meestal oligo-dT, omdat eukaryotische mRNAs eindigen met een poly-A staart Voor ander RNA wordt een specifieke primer gebruikt die ergens aangrijpt op het RNA (als de sequentie tenminste bekend is). Ander RNA = bv. Viraal RNA

14 RT-PCR RT-PCR kan tegenwoordig met 1 thermostabiel DNA polymerase worden uitgevoerd. Bv: rTth = recombinant Thermus Thermophilus DNA - polymerase

15 Real Time PCR Een PCR methode waarbij de synthese van het PCR product (of de producten) tijdens de PCR gevolgd kan worden. Dit in tegenstelling tot de gewone PCR wat een eindpunt PCR is. De Real Time PCR is niet hetzelfde als de RT-PCR. Real Time PCR kan op DNA en op RNA (realtime RT-PCR) worden uitgevoerd. Bij RNA start de procedure met een RT stap. De Real Time PCR is een kwantitatieve methode.

16 Real Time PCR is een veel snellere methode dan de gewone PCR
Er wordt een speciaal PCR apparaat voor gebruikt nl. een thermocycler met een optisch systeem gebruikt.

17 De PCR reactie wordt uitgevoerd in capillairtjes, waardoor de Ramp tijd veel korter wordt.
Een PCR van 50 cycli kan al in 30 minuten klaar zijn.

18 Real Time PCR Bij de Real Time PCR wordt gebruik gemaakt van fluorescerende stoffen om de hoeveelheid gesynthetiseerd DNA te kunnen meten; er zijn verschillende methoden ontwikkeld. De Taqman probe Syber Green …………….

19 Het principe van fluorescentie
Het principe van fluorescentie berust op de absorptie van fotonen door een molecuul (fluorofoor) dat daardoor in een geëxciteerde conformatie komt. Het geëxciteerde molecuul zal terugkeren naar zijn (gewone) = grondtoestand en zendt daarbij fotonen uit. Het  licht  dat hierbij uitgestraald  wordt  (emissie)  zal  door  ineffi- ciënte  energetische  conversie (verlies aan energie) van een  grotere golflengte zijn dan het excitatie licht.

20 Nogmaals het principe van fluorescentie
De fotonen van UV licht brengen electronen van het fluorofoor naar een hoger energie niveau. Dit is maar zeer tijdelijk (instabiel). Wanneer de electronen naar hun oude niveau terugvallen zenden ze licht uit . Dat licht heeft een hogere golflengte omdat er onderweg al energie verloren is gegaan Excitatie Emissie emissielicht fotonen

21 Real time PCR: de Taqman probe
De Taqman probe is een enkelstrengs oligonucleotide met aan de 5’-kant een Reporter fluorofore groep en aan de 3’-kant van hetzelfde DNA molecuul een Quencher fluorofore groep. R = reporter; fluoresceert na aanstraling door korte golflengtes en geeft dan groen licht Q = Quencher; fluoresceert door lange(re) golflengtes en geeft dan rood licht

22 Taqman PCR De Taqman probe bindt aan het ss PCR product tijdens de annealingsfase, tegelijk met de primers. Het groene licht dat R uitzendt als hij geactiveerd is wordt door de quencer Q opgevangen. Er is dan geen groen licht te zien!!! Dit gebeurt als R vlakbij Q zit, zoals hiernaast aangegeven.

23 Tijdens de synthesestap komt het DNA polymerase de probe tegen
Tijdens de synthesestap komt het DNA polymerase de probe tegen. Met de 5’→ 3’ exonuclease activiteit van het DNA Polymerase enzym wordt de Taqman probe nt voor nt afgebroken. De afstand tussen de vrijgekomen Reporter en de Quencher wordt nu veel groter. Het emissielicht van de Reporter wordt nu niet meer opgevangen door de Quencher en kan nu worden gemeten!!!!! Hoe meer taqman probes hebben kunnen binden des te meer fluorescentie er gemeten wordt. Het Taq-polymerase breekt tijdens de synthese de Taqman probe af.

24

25 Real Time PCR = kwantitatief
De hoeveelheid emissielicht van de reporter wordt 1 x per cyclus gemeten. De hoeveelheid fluorescentie wordt direct weergegeven op het computerscherm. Het aantal cycli dat nodig is voordat je de fluorescentie kan meten geeft informatie over de hoeveelheid DNA of RNA dat in het monster aanwezig was. De Real time PCR is dus behalve snel ook een kwantitatieve PCR

26 Real time PCR is een kwantitatieve methode
amplificatieplot Tijdens de eerste x cycli wordt de achtergrond aan fluorescentie gemeten. Op grond hiervan wordt de “baseline” ingesteld (de 0-lijn) Daarna wordt afgesproken/ ingesteld welke waarde de Threshold lijn krijgt. Het cyclusnummer waarbij de fluorescentiewaarde voor de eerste keer boven de Threshold uitkomt wordt de CT waarde genoemd (Threshold Cycle) De Ct waarde is een maat voor de hoeveelheid DNA die oorspronkelijk in het monster zat.

27 Er is een lineair verband tussen de CT waarde en de logaritme van het aantal DNA moleculen dat bij de start van de PCR aanwezig was (A). Door de CT-waarde uit te zetten tegen de logwaarde van het aantal DNA moleculen (bij de start van de PCR reactie) ontstaat een ijklijn (de CT-DNA-plot). Hiermee kan dus altijd het aantal aanwezige DNA (of RNA) moleculen in het onbekende monster berekend worden.

28 de Taqman PCR Nadeel: er is, naast de twee primers, een specifieke probe nodig voor het te maken PCR product. Voordeel: Als de probe bindt is het PCR produkt het specifieke produkt Een andere manier om bij REAL TIME PCR de hoeveelheid gemaakt DNA te bepalen maakt geen gebruik van een probe, maar van de intercalatie van een fluorescerende kleurstof, bv. SYBR Green.

29 Real time PCR met SYBR Green is een fluorochroom die net als ethidium bromide in ds DNA intercaleert. Zodra het fluorochroom in het ds DNA zit fluoresceert het een factor 100 x sterker dan als het niet in het DNA zit! Tijdens de PCR reactie wordt CYBR Green ingebouwd in het DNA. Hoe meer DNA er is gemaakt des te meer fluorescentie er wordt gemeten.

30 Real time PCR met De optimale golflengte van het excitatielicht van SYBR Green is zichtbaar licht van 470 nm. Er is geen probe nodig om het DNA te detecteren zoals bij de Taqman probe!!! De Fluorescentie van SYBR Green geeft alleen maar aan dat er DNA wordt gemaakt. Je weet niet of het het juiste PCR product is. Na de PCR reactie wordt daarom een smeltcurve van het gePCRde DNA gemaakt.

31 De smeltcurve als identificatiemiddel van het gePCRde DNA
Ieder PCR reactiemengsel wordt in 4 – 5 ‘ verhit tot 95°C, waarbij de absorbantie wordt gemeten. De resultaten worden vergeleken met die van de positieve controle en van 2 negatieve controles (blanco’s).

32 Uit de smeltcurve kan de Tm worden vastgesteld.
De smeltcurve als identificatiemiddel van het gePCRde DNA De eeste piek (74 °C) is van de primer-dimer. Het gewenste PCR product heeft een piek bij 81,5 °C. Animal Health Service R&D - Mycoplasma

33 Een voorbeeld van een Real Time 3 staps PCR protocol
Aantonen van mycoplasma’s 50 x : 5’’ 55 °C, 10’’ 72 °C, 0’’ 95°C Het gemaakte product is ongeveer 100 bp Na de PCR reactie (binnen een half uur klaar) wordt ieder monster in 4 – 5 ‘ uitgesmolten tot 95°C. Sybr green is gebruikt

34 Een voorbeeld van een 2-staps PCR
Hier wordt de Taqman probe gebruikt voor de detectie van Bovine Virale Diarree in serum. 20 ‘ RT stap 15’ 95 °C 50 x : 20” 95 °C 40” 60 °C De annealing en de synthese vinden bij dezelfde temperatuur plaats.

35 Contaminatie Omdat de PCR in korte tijd zeer veel kopieen maakt van een aangeboden template (matrijs/monster) is dat zowel de kracht als de valkuil van deze techniek. In principe is 1 DNA of RNA molekuul al voldoende om als matrijs te functioneren. Het gevaar dat een ongewenst DNA – of RNA molekuul tijdens de PCR reactie aanwezig is, is dus heel reeel. Er kunnen door contaminatie vals positieve uitslagen ontstaan. Wat kan contaminatie veroorzaken????? Hoe voorkom je contaminatie?????? Hoe controleer je op contaminatie???????

36 Contaminatie Wat kan contaminatie veroorzaken??????
(Vorige) PCR producten Positieve controles (bv. DNA fragment of een plasmide) Haar of huidcel Aerosolen microben

37 Contaminatie Hoe voorkom je contaminatie?????
Gebruik steriele of gesteriliseerde materialen Pipetten met filtertips (i.v.m. aerosol vorming) Handschoenen Wegwerpmaterialen Werk in een flowkast bij het maken van de benodigde oplossingen en het klaarmaken van de PCR mix Gebruik schone jassen, aparte apparaten en materialen voor de PCR Fysische scheiding werkzaamheden PCR-mix klaarmaken in aparte ruimte Monsterbereiding in aparte ruimte Controle op PCR producten in andere ruimte Ruimte I: bereiding reagentia Ruimte II: monsteropwerking Ruimte III: amplificatie/detectie Voer de PCR uit onder stringente omstandigheden Gebruik speciale nucleotiden zoals: UNG- dUTP

38 Het gebruik van dUTP Uracil-DNA glycosylase is een enzym dat dUTP in DNA afbreekt. dUTP kan ontstaan uit de-aminatie van dCMP.

39 Contaminatie Hoe controleer je op contaminatie???????
Neem bij iedere PCR de nodige controles mee: Een positieve controle die het juiste product oplevert Een negatieve controle die niets mag opleveren (i.p.v. monster water) Interne controle; deze matrijs moet onder de juiste PCR omstandigheden altijd een PCR product opleveren.