LENGTE METEN VAN EEN GENOOM

Presentatie over: "LENGTE METEN VAN EEN GENOOM"— Transcript van de presentatie:

1 LENGTE METEN VAN EEN GENOOM
Mol. Gew. E.coli genoom is 2.6 x 107 of 4.6 x 106 baseparen of 4600 KBP of 4.6 mega-baseparen. Een helix bevat 10 baseparen en is 3.4 nm lang. Lengte van de DNA draad is 4.6 x 106 x 0.34 nm = 1564 mm. Grootte cel is ongeveer 1 mm

2

3

4

5

6

7

8

9

10 DENATURATIE-RENATURATIE-
Annealing Probe Primer Baseparing Enkelstrengig naar dubbelstrengig DNA DENATURATIE-RENATURATIE- HYBRIDISATIE

11 The result is a double stranded
molecule organised in a double helix Note that the strands or oriented in the opposite direction The bases are connected via H-bridges: two H-bridges for the A=T pair and 3 for the G C pair

12 Native (Double helix) Denatured (random coil)

13 Melting curve: Tme

14

15

16 PARAMETERS VAN ZUIVER DNA
1 mg DNA per ml komt overeen met een OD260 van ongeveer 2 OD260/OD280 tussen 1.8 en 2.2 OD234/OD260 ongeveer 0.5

17

18

19

20

21

22

23

24 Comparison of prokaryotic cells and eukaryotic organelles
Prokaryotic cell Eukaryotic cell Eurakyotic organelles (mitochondria & chloroplasts) DNA circular linear circular Histones histone-like yes no proteins Ribosomes 70S 80S 70S ssu rRNA 16S 18S 16S Growth binary fission mitosis binary fission

25

26

27 MOLECULAIR KLONEREN Uit een komplex genoom een klein deel halen en inbrengen in een eenvoudige vector die zich zeer vlug kan vermenigvuldigen DNA mRNA vector cDNA transformatie vector transformatie Genoom bib cDNA bib

28

29 Restrictie en aantal fragmenten
4 x 10 6 BP (E. coli), kans op voorkomen van een restrictie site Is 1/ 4n, waarin n het aantal basen is in de site aantal fragmenten fragment grootte (Nf=S/4n) Tetracutter 4.6x106/256=~ ~260 BP Hexacutter ~ ~ 4000 BP Octacutter ~ ~ BP

30 DNA restrictie splicing In vector fragmenten cDNA In vector Transformatie of transductie Genoom bib:109 cellen waarin al dan niet de vector met al dan niet een vreemd restrictiefragment cDNA bib:109 cellen waarin al dan niet de vector met al dan niet een vreemd exon

31 ln(1-p)   N = ln(1-f)  N = aantal clones P = probabiliteit om een bepaalde sequentie op te sporen F = fractie van het genoom aanwezig in iedere clone Menselijk genoom wordt geschat op 3 x 106 KBP   Indien men veronderstelt dat in er in Lambda een insert van 17 KBP ingebouwd is, wordt : 1.7 x 104 f = 3 x 109 en betekent dit dat 8.1 x 105 fagen nodig zijn om 99% kans te hebben dat om het even welk menselijk gen in op zijn minst één clone zal aanwezig zijn. Indien men pBR322 zou gebruikt hebben (insert van 5 KBP) dan zou de bibliotheek verschillende miljoenen klones moeten bevatten om het gehele genoom te bestrijken.

32 SCREENEN VAN DE BIBLIOTHEKEN
Welke gastheercellen bevatten de vector? 2. Bevat de vector vreemd DNA? 3. Identificatie van het vreemd DNA Via het DNA Via het eiwit

33 WELKE GASTHEERCELLEN BEVATTEN
DE VECTOR? Antibiotica resistentie Lac Z complementatie

34 2. WELKE VECTOREN BEVATTEN
VREEMD DNA? Tweede antibiotica resistentie Lac Z complementatie

35 IDENTIFICATIE VAN DE CLONES
Via het DNA: Probe via reverse translation cDNA, PCR technieken, Subtractieve hybridisatie. Via het eiwit indien het tot expressie komt: Immunologie, Western blot, Gevoelige signalisatie gebruiken

36

37