Eiwitonderzoek bij ziekten

Presentatie over: "Eiwitonderzoek bij ziekten"— Transcript van de presentatie:

1 Eiwitonderzoek bij ziekten
Jolein Gloerich

2 VWO Bernardinuscollege Heerlen Natuur & Techniek profiel

3 Scheikunde Universiteit Utrecht
Afstudeerrichting Biochemie Waarom? Uitdagende studie Chemische processen in het lichaam

4 Universiteit van Amsterdam Academisch Medisch Centrum
Promotie onderzoek 4 jaar Laboratorium Erfelijke Stofwisselingziekten Eiwitonderzoek

5 Radboud Universiteit Nijmegen Universitair Medisch Centrum
Wetenschappelijk onderzoek Laboratorium Kindergeneeskunde & Neurologie Erfelijke stofwisselingsziekten Nijmegen Proteomics Facility

6 Kijken naar alle eiwitten Identificatie van eiwitten
Overzicht Inleiding Eiwitten en ziekte Kijken naar alle eiwitten 2 technieken om eiwitten te scheiden Identificatie van eiwitten Massaspectrometer Wat hebben we hieraan???

7 Onderzoek naar ziektes: eiwitten!!!
Inleiding Eiwitten A B Onderzoek naar ziektes: eiwitten!!!

8 Inleiding Eiwitsynthese DNA RNA Eiwit

9 Inleiding Eiwitsynthese DNA RNA Eiwit

10 Inleiding Eiwitsynthese DNA RNA Eiwit

11 Inleiding Eiwitten Aminozuren Verschillende eigenschappen Basisch/zuur
Hydrofiel/hydrofoob Lading

12 Aantal aminozuren/massa
Inleiding Eiwitten Aminozuren Verschillende eigenschappen Volgorde aminozuren Aantal aminozuren/massa

13 Inleiding Erfelijke ziekte

14 Eiwit met fout aminozuur:
Inleiding Fout in DNA: Eiwit met fout aminozuur: Geen invloed op functie Eiwit werkt niet meer Geen eiwit aanwezig

15 Inleiding Erfelijke ziekte A B

16 Inleiding Erfelijke ziekte A B

17 Inleiding A B C

18 Inleiding Regulatie A B C

19 Inleiding Alle eiwitten in een weefsel → proteoom Kijken naar alle eiwitten → proteomics Hoeveel eiwitten zijn er ???? In totaal: ± eiwitten In een weefsel: ±

20 Inleiding Cel: alle genen aanwezig, maar niet alle eiwitten! Soorten eiwitten afhankelijk van functie:

21

22

23 Inleiding Onderzoek naar ziekte Gezonde persoon Patiënt

24 Inleiding Onderzoek naar ziekte
Kijken naar verschillen in eiwitten: Aanwezig/afwezig Verschil in concentratie

25 Inleiding Probleem: 4000 verschillende eiwitten in weefsel
Hoe kunnen we afzonderlijke eiwitten bekijken? Scheiden van elkaar

26 Scheiding van eiwitten op lading
De lading van een aminozuur in oplossing is afhankelijk van de pH Het iso-elektrisch punt is de pH waarbij de netto lading van een aminozuur 0 is, dus evenveel postieve als negatieve ladingen

27 Scheiding van eiwitten op lading
Een eiwit heeft ook een iso-elektrisch punt, dus een pH waarbij de netto lading 0 is. pH=3 pH=7 pH=9 - + - + - + Lading: +3 -2

28 Scheiding van eiwitten op lading
Netto lading Iso-elektrisck punt 3 2 1 pH -1 -2 -3

29 Scheiding van eiwitten op lading Iso-Elektrische Focusing (IEF)
pH Mengsel van eiwitten Elektrisch veld aanbrengen - + Scheiding op lading gelukt !!!

30 Scheiding van eiwitten op massa
zeef Gel van polyacrylamide Deze scheiding duurt heel lang….

31 Scheiding van eiwitten op massa
…. Hoe kunnen we het sneller maken? Alle eiwitten een negatieve lading geven met SDS…. …. een elektrisch veld ‘trekt’ (negatieve) eiwitten sneller door de gel Gel-elektroforese

32 Scheiding van eiwitten op massa
Gel-electroforese - + Moleculair gewicht (Mw)

33 Scheiding van eiwitten op massa
Gel-electroforese - + Moleculair gewicht (Mw)

34 Scheiding van eiwitten op massa
Gel-electroforese 15 20 35 45 60 75 95 110 Moleculair gewicht (Mw)

35 Scheiding van eiwitten
Lading EN massa IEF Iso elektrisch punt - +

36 Scheiding van eiwitten
Lading EN massa IEF Iso elektrisch punt - + Moleculair gewicht SDS gel-elektroforese

37 Scheiding van eiwitten
Lading EN massa IEF Iso elektrisch punt - + Moleculair gewicht SDS gel-elektroforese

38 Scheiding van eiwitten 2-D (lading en massa)
Na kleuring van eiwitten: Kaart van bijna alle eiwitten in een weefsel veel eiwit weinig eiwit felle stip vage stip

39 Vergelijking gezond-ziek
2-D scheiding van eiwitten uit weefsel van patient en controle Nooit helemaal hetzelfde…

40 Vergelijking gezond-ziek
… daarom: tegelijkertijd patient en controle bekijken Mixen van eiwitten patient en controle Alles op één hoop Geen verschil meer te zien +

41 Vergelijking gezond-ziek
Label alle eiwitten ROOD fluorescent Patient eiwitten Controle Mix Label alle eiwitten GROEN fluorescent Alle eiwitten krijgen een kleurlabel Patient: ROOD Gezond: GROEN

42 Vergelijking gezond-ziek
Groene en rode eiwitten mixen en in 1x scheiden met 2-D scheiding =ROOD =GROEN veel eiwit weinig eiwit felle stip vage stip

43 Vergelijking gezond-ziek
Mix van groen en rood: [eiwit]=[eiwit]: gele stip [eiwit]>[eiwit]: groene stip [eiwit]<[eiwit]: rode stip =ROOD =GROEN

44 Vergelijking gezond-ziek
Vooral groene en rode stippen zijn verschillend in patient en controle Welke eiwitten zijn dit?? =ROOD =GROEN

45 Identificatie van interessante eiwitten
Stipje uit de gel snijden: Elke stip is 1 eiwit Maar welk eiwit is dit?? =ROOD =GROEN

46 Vergelijking gezond-ziek Eiwit isoleren
IEF Gel elektroforese Eiwit Uit gel snijden `` Interessant eiwit Eiwit zit nog in gel Voor identificatie: eiwit uit gel halen Hoe??

47 Eiwit identificatie Eiwit in gel Trypsine: enzym betrokken bij
Digestie met trypsine Trypsine: enzym betrokken bij eiwitafbraak. Knipt na elke Arg en Lys Peptiden Uit gel door diffusie

48 Eiwit identificatie Massaspectrometrie
Combinatie van peptiden Uniek voor een eiwit Ook de combinatie van massa’s is uniek voor dit eiwit! Massa’s kun je meten met een massaspectrometer

49 Identificatie van een eiwit
tryptic digestion Gel Protein Database ? 1 2 3 compare: “?” is identical to “2” mass spectrometry stored data or “theoretical” peptides

50 Massaspectrometrie van peptiden
Massaspectrometer: Weegschaal voor ionen Massa/lading (m/z) Dus: peptiden ioniseren!!!

51 Massaspectrometrie Ionisatie van peptiden
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI)

52 Massaspectrometrie Ionisatie van peptiden
MALDI plaat Opbrengen van peptiden/matrix mix

53 Massaspectrometrie Massaspectrometer (MS)
Laser + Detector TOF-MS Molecular weight Intensity Time of Flight (ToF) MS Lichte ionen Vliegen sneller Dan zware ionen

54 Massaspectrometrie Massaspectrometer (MS)

55 Vergelijking gezond-ziek
IEF Gel elektroforese Eiwit Uit gel snijden `` Interessant eiwit ToF MS Identificatie Eiwit !!!

56 Vergelijking gezond-ziek Welke eiwitten verschillen?
We weten welke eiwitten in concentratie verschillen… … Wat kunnen we daarmee???? Test maken voor diagnose van ziekte

57 Vergelijking gezond-ziek Welke eiwitten verschillen?
We weten welke eiwitten in concentratie verschillen… … Wat kunnen we daarmee???? Leren wat er precies gebeurt In een weefsel bij een ziekte Welke eiwitten spelen een rol? Belangrijk voor ontwikkeling medicijnen

58 Laboratorium Kindergeneeskunde en Neurologie Proteomics unit: Dr. Bert van den Heuvel Dr. Jolein Gloerich Ing. Maurice van Dael Ing. Lambert Lambooy Ing. Hans Wessels