basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

Presentatie over: "basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie"— Transcript van de presentatie:

1 basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
Deel 1 door Peter Roels Monitoraat Wetenschappen K.U. Leuven

2 basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning polymerase-kettingreactie DNA-sequentiebepaling Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

3 basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning polymerase-kettingreactie DNA-sequentiebepaling Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

4 DNA-dubbelhelix Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

5 DNA-dubbelhelix 5’ TGA 3’ 3’ ACT 5’ Vliebergh 2004
DNA! Natuurlijk, maar...

6 basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning polymerase-kettingreactie DNA-sequentiebepaling Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

7 3 pijlers in de recombinant-DNA-technologie
complementaire basenparing restrictie-enzym of restrictie-endonuclease DNA-polymerase Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

8 complementaire basenparing
steeds: adenine – thymine (2 H-bruggen) guanine – cytosine (3 H-bruggen) van groot belang in biologische werking, o.a.: DNA-replicatie RNA-synthese cruciaal in vele technieken! Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

9 complementaire basenparing
temperatuur absorbantie es DNA DENATURATIE ds DNA Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

10 complementaire basenparing
temperatuur absorbantie Ts Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

11 complementaire basenparing
temperatuur absorbantie < Ts GC-gehalte < Ts Ts Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

12 complementaire basenparing
temperatuur absorbantie es DNA RENATURATIE ds DNA Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

13 complementaire basenparing
ook tussen niet perfect complementaire strengen is renaturatie (hybridisatie) mogelijk algemene regel: - smelttemperatuur van deze dubbelhelix lager naarmate aantal complementaire basen afneemt - hoe meer de strengen complementair aan elkaar, hoe hoger de temperatuur van het medium vóór denaturatie Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

14 restrictie-enzymen herkent en knipt welbepaalde sequentie van nucleotiden (4 tot 8 bp) herkenningssequentie is palindroom 5’...GAATTC...3’ 3’...CTTAAG...5’ Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

15 restrictie-enzymen herkent en knipt welbepaalde sequentie van nucleotiden (4 tot 8 bp) herkenningssequentie is palindroom vaak met vorming “kleverige eindjes” 5’...GAATTC...3’ 3’...CTTAAG...5’ ...G AATTC... ...CTTAA G... Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

16 DNA-polymerase maakt vanaf aparte nucleotiden DNA-streng aan op enkelstrengse matrijs steeds dubbelstrengs DNA nodig als start steeds aangroei nieuwe DNA-streng aan 3’-uiteinde 3’...CTTAAG... 5’ 5’...GA ’ Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

17 DNA-polymerase maakt vanaf aparte nucleotiden DNA-streng aan op enkelstrengse matrijs steeds dubbelstrengs DNA nodig als start steeds aangroei nieuwe DNA-streng aan 3’-uiteinde 3’...CTTAAG... 5’ ATTC... 5’...GA ’ Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

18 basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning polymerase-kettingreactie DNA-sequentiebepaling Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

19 restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)
digestie van DNA met restrictie-enzym Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

20 restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)
digestie van DNA met restrictie-enzym Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

21 restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)
digestie van DNA met restrictie-enzym Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

22 restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)
digestie van DNA met restrictie-enzym gelelektroforese (met agarosegel) Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

23 gelelektroforese: opzet stalen
 Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

24 gelelektroforese: opzet stalen
 Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

25 gelelektroforese: spanning
- + Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

26 gelelektroforese: spanning
- + Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

27 gelelektroforese: spanning
- + Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

28 gelelektroforese: visualisatie
1000 500 300 200 100 - + Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

29 gelelektroforese: visualisatie
- + Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

30 restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP)
digestie van DNA met restrictie-enzym gelelektroforese (met agarosegel) interpretatie Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

31 gelelektroforese: interpretatie
 400 50 Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

32 gelelektroforese: interpretatie
 5’…CAATT ’ 3’…G ’ 5’ G…3’ 3’ TTAAC…5’ 400 50 5’…CAACTG…3’ 3’…GTTGAC…5’ 5’…CAATTG…3’ 3’…GTTAAC…5’ Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

33 gelelektroforese: interpretatie
 400 50 Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

34 gelelektroforese: interpretatie
 400 50 5’…CGGTCTAGGTG…3’ 3’…GCCAGATCCAC…5’ 5’…CGGTCTAGGTG…3’ 3’…GCCAGATCCAC…5’ 5’…CGGGGTG…3’ 3’…GCCCCAC…5’ Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

35 gelelektroforese: interpretatie
 400 50 Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

36 gelelektroforese: interpretatie
 400 50 Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

37 resultaat na digestie van totaal genomisch DNA
 400 50 Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

38 basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning polymerase-kettingreactie DNA-sequentiebepaling Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

39 Southern-vlektechniek
agarosegel nylondrager blotting autoradiogram + sonde radiografie 5’…AACTCAGCTG … 3’ 5’ … AACTC 3’ 5’ AGCTG … 3’ 3’ GAGTCG 5’ 3’ GAGTCG 5’ Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

40 Southern-vlektechniek: afkomst sonde (probe)
uit gekende aminozuursequentie van eiwit (degeneratie code!) uit mRNA, na omzetting in cDNA sonde gebruikt in een ander, verwant organisme (voldoende complementair!) Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

41 basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie
DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning polymerase-kettingreactie DNA-sequentiebepaling Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

42 genkloning specifieke amplicatie van DNA-fragment
5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ lacZ-gen (enzym katalyseert omzetting “X-gal” naar blauwe kleurstof) pUC18 ampicillineresistentiegen Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

43 genkloning specifieke amplicatie van DNA-fragment
5’ GAATTC GAATTC 3’ 3’ CTTAAG CTTAAG 5’ 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

44 genkloning specifieke amplicatie van DNA-fragment
5’ GAATTC GAATTC 3’ 3’ CTTAAG CTTAAG 5’ 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ GAATTC CTTAAG Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

45 genkloning specifieke amplicatie van DNA-fragment
+ ampicilline + X-gal bacterie – plasmide = niet-AB-resistent plasmide zonder donor-DNA = blauw Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

46 genkloning specifieke amplicatie van DNA-fragment
blotting radiografie Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...

47 genkloning specifieke amplicatie van DNA-fragment
Vliebergh 2004 DNA! Natuurlijk, maar...