Laboratorium diagnostiek van cystine dr. Leo A. J. Kluijtmans Lab

Presentatie over: "Laboratorium diagnostiek van cystine dr. Leo A. J. Kluijtmans Lab"— Transcript van de presentatie:

1 Laboratorium diagnostiek van cystine dr. Leo A. J. Kluijtmans Lab
Laboratorium diagnostiek van cystine dr. Leo A.J. Kluijtmans Lab. Genetische, Endocrine en Metabole Ziekten UMC St Radboud

2 Inhoud presentatie Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten
(Klein beetje) biochemie Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten Meting cystine (eigenlijk: cysteine) Hoe kunnen we elkaar vinden Vragen

3 Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten
Gespecialiseerd laboratorium op het terrein van de erfelijke stofwisselingsziekten (metabole ziekten) Ca. 170 fte, waarvan de ~50% in de diagnostiek 8 stafleden, waarvan 2 in de metabolieten diagnostiek (lichaamsvloeistoffen) Ca nieuwe patiënten / jaar

4 Het UMC St Radboud, Nijmegen

5 LGEM laboratorium

6 LGEM laboratorium

7 De humane cel Lysosoom Celmembraan Mitochondrion
Endoplasmatisch reticulum Cytoplasma Kernmembraan Kernporie Kern Kernlichaampje Ribosoom Golgi-systeem.

8 Het lysosoom Ontdekt in 1949 door Christian de Duve
De stofzuigers van de cel Afbraak van allerlei celcomponenten (vetten, eiwitten, complexe suikers, erfelijk materiaal) Afbraakproducten gaan naar cel plasma Zuur milieu (zuurtegraad (pH): ~5); cel: ~7.2

9 De belangrijkste spelers
Cysteine: HOOC HC-CH2-SH ( ) NH2 Cystine: HOOC COOH HC-CH2-S-S-CH2-CH ( ) NH NH2 Cysteamine: NH2-CH2-CH2-SH ( ) COOH Cysteamine-cysteine disulfide: NH2-CH2-CH2-S-S-CH2-CH ( )

10 Cysteine-transporter
Hoe gaat het ‘normaal’? cystine Cystine-transporter Cysteine-transporter Lysosoom Lysine-transporter De cel

11 Wat gebeurt er bij Cystinosis
cystine cystine Cystine-transporter Cysteine-transporter Lysine-transporter Lysosoom De cel

12 Wat gebeurt er bij Cystinosis
cystine Cystine-transporter Cysteine-transporter Lysine-transporter Lysosoom De cel

13 Werking van cysteamine
Cystìne-transporter cysteamine Cysteine-transporter cysteine Lysine-transporter Lysosoom De cel

14 Diagnose cystinosis Cystine stapelt in lysosoom tgv het transporter defect Cystine is (fors) verhoogd in m.n. de granulocyt (= witte bloedcel waarin veel lysosomen zitten) Cystine is ook verhoogd in gekweekte huidfibroblasten DNA diagnostiek van het Cystinosine gen (17p13)

15

16 Wat zijn de ‘challenges’
Isolatie granulocyten uit bloed Vermijden contaminatie met andere bloedcellen (mn rode) Vermijden artificiële vorming van cystine uit cysteine Oxidatie van cysteine geeft cystine Rode- en witte bloedcellen bevatten veel cysteine

17 (polymorphonucleaire cellen)
Granulocyt isolatie (polymorphonucleaire cellen)

18 Leukocyt isolatie, procedure
Met behulp van dextraan (complex suiker molecuul) worden de bloedcellen gescheiden Aan buis bloed wordt dextraan toegevoegd, incubatie 1 uur op ijs.

19 Dextraan incubatie, 1 uur op ijs
Leukocyten (witte cellen) Erythrocyten (rode cellen)

20 Het leukocyten isolaat
Neutrofiele granulo Eosinofiele granulo Basofiele granulo Lymfocyt Monocyt 35-75% 0-5% 0-2% 15-40% 0-6% Totaal: x 109 per liter granulocyten

21 Dextraan incubatie Leukocyten (witte cellen)
Erythrocyten (rode cellen)

22 Granulocyt isolatie uit leukocyt suspensie
Het leukocyten isolaat wordt behandeld met Ficoll (= complexe suiker). Ficoll wordt onder leukocyt suspensie gepipetteerd (géén menging lagen) Centrifugatie, 20 min, 4°C, 500g (1800 rpm) Scheiding op soortelijk gewicht

23 De Centrifuge

24 De Ficoll gradient lymfocyten granulocyten
Echter nog wel mét rode bloedcellen erbij

25

26 Contaminatie met rode bloedcel
Rode bloedcellen nemen makkelijk water op uit hun omgeving Plaats rode bloedcellen in een “waterige omgeving” en ze zullen opzwellen en barsten + 3 mL ijskoude MilliQ (= zuiver labwater)

27 Wassen en opslag geïsoleerde granulocyten
De geïsoleerde granulocyten worden 3 x gewassen met fysiologisch zout (PBS). Tussendoor: centrifugeren 10 min, 4°C, 500g Afzuigen wasbuffer en invriezen in vloeibare stikstof (-196°C) Opslag in -80°C vriezer tot analyse

28

29 Meting cystine uit de granulocyt met HPLC

30 Andere –SH verbindingen
Wat is de situatie ? HOOC HC-CH2-SH NH2 De cel Lysosoom cysteine Andere –SH verbindingen cystine

31 Cellen kapot maken

32 Als we cellen kapot maken, komt er zuurstof bij…
Door “oxidatie” krijgen we foutief verhoogd cystine uit 2 moleculen cysteine Vals verhoogd cystine

33 De oplossing… N-ethylmaleimide (NEM)
Het NEM reageert met –SH verbindingen (o.a cysteine)

34 Als we cellen kapot maken, in aanwezigheid van NEM ( )
in overmaat Het NEM bindt aan alle –SH groepen en vangt daarmee ook het aanwezige cysteine weg Het bindt NIET aan cystine

35 Complex mengsel van verbindingen
Cystine ( ) is moeilijk te meten. Cysteine ( ) is makkelijk te meten!

36 Complex mengsel van verbindingen

37 Het complexe mengsel In het isolaat zit nog cystine (moeilijk meetbaar) en verder het cysteine-NEM en andere SH-NEM stoffen. De overmaat aan NEM is weggevangen en kan géén cysteine meer binden Na wegvangen overmaat NEM kunnen we cystine “breken” tot 2 x cysteine en dit meten. Er wordt een ‘kleurstof’ specifiek voor cysteine toegevoegd

38 Complex mengsel van verbindingen
Gekleurd cysteine te meten met fluorescentiedetector

39 Cysteine meting met HPLC
HPLC: High Performance Liquid Chromatography (hogedruk vloeistof chromatografie) Chromatografie: het scheiden van een mengsel van stoffen op basis van hun eigenschappen

40 Hoe werkt HPLC?

41 De ‘cystine’ HPLC in het lab.

42 De HPLC kolom waarop de stoffen gescheiden worden

43 De vloeistoffen

44 De monster verwisselaar van de HPLC

45 Cysteine kwantificeren
Om de hoeveelheid te kunnen bepalen wordt een zogenaamde ijklijn opgenomen. Bekende concentraties cysteine worden geanalyseerd en piekoppervlakten worden gemeten

46 Chromatogram Diverse bekende (!) concentraties cysteine in tweevoud bepaald op de HPLC. Computer berekent het piekoppervlak.

47 Van piekoppervlak naar concentratie
Oppervlakte piek Hoeveelheid cysteine In patiëntenmonsters wordt het piekoppervlak van de cysteine piek bepaald en met behulp van de ijklijn wordt cysteine concentratie bepaald. Stel: piekopp is ; dan is de bijbehorende cysteine concentratie: µM

48 Van cysteine concentratie naar uitslag
Oppervlak ~ Concentratie cysteine Cysteine is afkomstig van cystine (= ½ cystine) Cysteine concentratie wordt gehalveerd. Hoeveelheid eiwit (in mg) is een maat voor de hoeveelheid geïsoleerde cellen. Uitslag is xx nmol cystine / mg eiwit.

49 Referentiewaarden / Targetwaarden
In gezonde personen: < 0.17 nmol/mg (in granulo’s) Targetwaarde: lager dan de range zoals gezien wordt bij “obligaat dragers” (dwz ouders van patiënten) Cystinosis is een autosomaal recessief ziektebeeld: Ouders zijn drager maar hebben géén klachten.

50 Wat bieden we aan in 2011? Kinderpoli: 11-01-2011
Volwassenen: Kinderpoli: Meetweek Nijmegen: week 4 (ma 24-01) Kinderpoli: Volwassenen: Kinderpoli: Meetweek Nijmegen: week 17 (ma 25-04) Kinderpoli: Kinderpoli: Volwassenen: Meetweek Nijmegen: week 26 (ma 27-06) Volwassenen: Kinderpoli: Kinderpoli: Meetweek Nijmegen: week 43 (ma 24-10)

51 Isolatie granulocyten in Nijmegen
In de 3 weken voorafgaand aan de Nijmeegse meetweek kunnen op maandag én woensdag bloedmonsters worden ingestuurd naar Nijmegen voor granulocyt isolatie in Nijmegen. Samples dienen te worden aangekondigd en moeten voor 12 uur in het lab zijn (ivm langdurige opwerking) Monsters worden dan in de eerstvolgende meetsessie meegenomen.

52 Ter afsluiting Veel stappen in de opwerking van de bloedmonsters tot een uitslag in nmol cystine/mg eiwit Complexe diagnostiek met veel ‘pitfalls’ Graag bereid met u van gedachte te wisselen hoe we de dienstverlening nog beter kunnen afstemmen op uw wensen.

53 Acknowledgments Analisten: Dinny van Oppenraaij-Emmerzaal
Jenneke Keizer-Garritsen Gwendolyn Beckmann Louk Geelen “Het Oude Team” Addy de Graaf-Hess Henk Blom Elena Levtchenko Marjolein Bos

54 Ter afsluiting nog een mooi plaatje…

55 ERNDIM, kwaliteitsrondzendingen
European Research Network Inherited Disorders of Metabolism