Immunoprecipitatie Immuno geeft aan dat je antilichamen gebruikt

Presentatie over: "Immunoprecipitatie Immuno geeft aan dat je antilichamen gebruikt"— Transcript van de presentatie:

1 Immunoprecipitatie Immuno geeft aan dat je antilichamen gebruikt
Wat is een antilichaam? Eiwit dat in een dier wordt geproduceerd als reactie op antigeen (een lichaamsvreemde stof, bv. een eiwit) Variabele deel bindt specifiek aan antigeen (Fab domein) Constante gedeelte (Fc domein)

2 Hoe wordt een antilichaam gemaakt?
Dier (konijn, muis, kip) produceert antilichamen als reactie op inbrengen antigeen Antilichaam materiaal verzamelen (bloed, eieren) - bevat antilichamen tegen veel verschillende antigenen!!! Zuiveren antilichamen uit dit materiaal (slechts een bepaald percentage van de antilichamen bindt aan specifiek antigeen)

3 Immunoprecipitatie Techniek om eiwitcomplexen te identificeren
- hierdoor wordt duidelijker welke functie deze eiwitten hebben Eiwit 2 Eiwit 1 GFP Eiwit 3 anti-GFP Een antilichaam herkent een van de eiwitten - vaak wordt een fusie eiwit gemaakt, bijv. met GFP

4 Voorbeeld immunoprecipitatie
(uit onderzoeksgroep van Dolf Weijers) Lokalisatie eiwit1-GFP in vaatweefsel plantenwortel Eiwit 1 GFP Eiwit 2 wild-type wortel zonder eiwit 1 (mutant) eiwit 2 abnormaal vaatweefsel Eiwitcomplex geeft informatie over de functie van het eiwit

5 Hoe voer je een immunoprecipitatie uit?
weefsel met eiwit-GFP malen anti-GFP toevoegen aan cel extract Eiwit 1 GFP Eiwit 2

6 Binden aan Protein A agarose
Eiwit 1 GFP Eiwit 2 agarose bolletje Protein A

7 Precipitatie eiwitcomplex door centrifugeren
vloeistof afpipetteren bolletjes wassen

8 Hoe voer je een immunoprecipitatie uit?
Eiwitcomplex denatureren en op gel laden Eiwitbandjes scheiden door electroforese, kleuren en uitsnijden SDS-polyacrylamide gelelectroforese

9 Proteomics: identificatie van de eiwitten
Voorbehandeling met iodoacetaat om de vrije SH groepen (cysteines) van de eiwitten te blokkeren door carboxymethylering

10 Proteolyse Eiwit in stukjes knippen met trypsine tot korte peptides

11 Voorbehandeling geëxtraheerde peptiden
De geëxtraheerde peptiden worden ontzout en gemengd met matrix oplossing. Dit mengsel wordt op een plaatje gebracht en verdampt zodat er kristallen van het matrixmateriaal en peptiden overblijven. Na bestraling door een laser en ionisatie (MALDI) worden de peptiden geanalyseerd met TOF mass spectrometrie.

12 MALDI-TOF spectrometer

13 Identificatie van eiwitcomplex
De massa van een polypeptide keten kan bepaald worden met de MALDI-TOF techniek. Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight

14 Massaspectrum tryptisch digest
Massa en lading van elk peptide worden geregistreerd Identificatie van de eiwitten

15 Voorwaarden voor succesvolle IP
Meer dan 1% van de IgG moleculen moet reageren met GFP Eiwit 1 GFP Eiwit 2

16 Uitvoering experiment
Testen van kwaliteit antilichaampreparaat Meer dan 1% van de IgG moleculen moet reageren met GFP Immunoprecipitatie en isolatie peptides Identificatie peptide(s) en Toekenning eiwitcomplex