Evaluatie van EBV VCA IgM en EBNA IgG op Vidas en VirClia

Presentatie over: "Evaluatie van EBV VCA IgM en EBNA IgG op Vidas en VirClia"— Transcript van de presentatie:

1 Evaluatie van EBV VCA IgM en EBNA IgG op Vidas en VirClia
Stijn Lefever Welkom iedereen op mijn presentatie van mijn eindwerk. Deze is de evaluatie van EBV VCA IgM en EBNA IgG op Vidas en VirClia

2 Inhoudstafel Epstein-Barr virus Methoden Resultaten Discussie Besluit
Vidas VirClia Resultaten Vidas EBNA IgG Vidas EBV VCA IgM VirClia EBNA IgG VirClia EBV VCA IgM Patiëntenstalen Discussie Besluit

3 Classificatie EBV Humaan herpesvirus 4 Meest voorkomende ter wereld
DNA virus Virale antigenen VCA EA EBNA VMA Het Epstein-Barr-virus (EBV) is een herpesvirus die ook wel humaan herpesvirus 4 (HHV-4) wordt genoemd. EBV is één van de meest voorkomende humane virussen die overal ter wereld voorkomt, dus iedereen wordt wel eens besmet met het Epstein-Barr virus. EBV is een DNA virus met een enveloppe die bestaat uit een dubbele fosfolipidenmembraan met daarop glycoproteïnes. De virale antigenen die daarbij voorkomen en gebruikt worden in de diagnostiek zijn: Viral capsid antigen (VCA) Early antigen (EA) Epstein-Barr nuclear antigen (EBNA) Viral membrane antigen (VMA)

4 Epidemeologie Mononucleosis infectiosa Associatie EBV: Primo-infectie
Burkitt lymfoom Narofaryngeaal carcinoom Hairy cell leukemie Primo-infectie Latent aanwezig Reactivaties Mononucleosis infectiosa wordt ook wel de ziekte van Pfeiffer genoemd. Een belangrijk kenmerk van dit virus is dat het na de natuurlijke primo-infectie latent aanwezig blijft in de lymfocyten. Dit virus kan reactiveren tijdens immuunsuppressie zoals bij hematologische aandoeningen, AIDS, transplantatie en immuunsuppressieve medicatie. De meest voorkomende symptomen van het Epstein-Barr-virus zijn: moeheid koorts keelontsteking gezwollen lymfklieren in de hals gezwollen lever vergrote milt

5 Transmissie Het Epstein-barr is zeer besmettelijk en verspreid zich via persoon tot persoon. Dit gebeurt voornamelijk via lichaamsvloeistoffen zoals speeksel maar ook via bloed en sperma tijdens seksueel contact, bloedtransfusies en orgaantransplantaties. De zieke van Pfeiffer of klierkoorts komt vooral voor bij kinderen of jonge volwassenen tot 20 jaar. De kans dat een kind besmet geraakt is groter in ontwikkelingslanden dan in Europa en Noord-Amerika. Dit is duidelijk te merken in de grafiek hieronder. Bij een leeftijd van 20 jaar is 80% tot 95% van de mensen besmet geraakt door EBV. Het virus zal dan meestal aanwezig zijn als drager en zich in een latente fase bevinden

6 Transmissie Het virus wordt meestal overgedragen via speeksel en dringt zo de cel binnen. Het binnendringen van de cel verloopt via een cyclus en deze bevat 4 grote stappen. Stap 1, Herkenning: Als het virus een geschikte gast cel heeft gevonden dan zal deze de oppervlakte afzoeken naar een receptor eiwit waaraan het kan binden. De glycoproteïnen van het virus binden op het membraan van de gast. Stap 2, Endocytose: Het Epstein-Barr virus fuseert met het membraan van de gastcel en gaat de cel via endocytose binnen. Stap 3, Replicatie: Na het binnengaan van de cel wordt het genetisch materiaal vermenigvuldigd door gebruik te maken van het metabolisme van de cel (kern en celorganellen). Eerst wordt er een polypeptide gemaakt door de cel die het DNA van de gastcel vernietigt. Na de vernietiging van het DNA van de gastcel start het virus de replicatie. Na verschillende keren te vermenigvuldigen wordt de replicatie gestopt en zullen de virus stukjes omvormen tot mature virussen. Een gastcel kan tot 200 complete virussen vermenigvuldigen. Stap 4, Exocytose: Nadat de virussen hun cyclus hebben doorlopen zullen ze uit de cel ontsnappen. Dit kan op twee manieren gebeuren afhankelijk van het type virus. Voor de meeste virussen is dit via een enzym dat het membraan zwakker maakt waardoor er water in de cel kan komen en de cel openbarst. De virussen verlaten dan de cel en infecteren andere gastcellen. Het Epstein-Barr virus verlaat de cel op een andere manier, namelijk via exocytose. Het virus neemt daarbij een klein stukje van het membraan mee.

7 Pathogenese De infectie start in de oropharynx om dan zo via het bloed zich te verspreiden. Het virus kan epitheelcellen infecteren en repliceren in de oropharynx vooraleer de B-cellen te infecteren. Naïeve B-cellen worden geïnfecteerd in mucosaal lymfoide weefsels en maakt een pool van latente EBV-geïnfecteerde cellen die lijken op geheugen B-cellen. Tijdelijke reactivatie van latente geheugen B-cellen kan er voor zorgen dat het virus via de oropharynx het lichaam terug verlaat om zo andere gastcellen te infecteren. De latente geïnfecteerde geheugen B-cellen blijven grotendeels levenslang in het lichaam en kunnen niet gedetecteerd worden doordat het een reactie is aangegaan met de cytotoxische T-lymfocyten. Hierdoor is er een verandering van de morfologie van de T-lymfocyten die zo een atypische vorm krijgen.

8 Laboratoriumdiagnose
Paul-Bunnell test Serologie Atypische lymfocyten Levertesten De laboratoriumdiagnose tijdens de dagelijkste routine bestaat uit vier parameters die moeten onderzocht worden.

9 Paul-Bunnell test De Paul-Bunnell test spoort heterofiele antistoffen op. Dit zijn antistoffen die tot de IgM-klasse behoren en dus maximaal drie tot zes maanden aanwezig blijven. Deze test is enkel bruikbaar bij jonge volwassen omdat heterofiele antistoffen niet worden aangemaakt bij kinderen en bij oudere volwassen. Daar is de reactie dus negatief. Bij ongeveer 90% van de jonge volwassen met Mononucleosis Infectiosa is de test positief. Bij kinderen en bij oudere volwassenen moeten voor de diagnose de IgM-antistoffen tegen het capside van het EBV VCA IgM worden bepaald

10 Serologie EBV VCA IgM IgM antistoffen tegen EBV VCA IgM zijn zichtbaar in de incubatieperiode en de acute infectie maar verdwijnen daarna traag na een periode van ongeveer zes weken. EBV VCA IgG EBV VCA IgG komt tevoorschijn in de acute fase van een EBV infectie. De maximale waarden zijn te zien na zes weken weken na de infectie. Het daalt traag en blijft levenslang in het lichaam. EBV EBNA IgG Er zijn verschillende EBNA IgG antistoffen waaronder EBNA-1 en EBNA-2. Enerzijds zijn er EBNA-1 die later worden geproduceerd bij een infectie. Deze blijven levenslang in het lichaam in uitzondering van bepaalde omstandigheden waaronder immuunsupressie. Anderzijds zijn er EBNA-2 antistoffen die veel vroeger tevoorschijn komen na een infectie. Bijvoorbeeld als EBNA-1 aanwezig is en EBNA-2 antistoffen niet dan kan een primo-infectie uitgesloten worden. (Hess, 2004) Antistoffen tegen EBNA IgG zijn beperkt aanwezig in de acute fase van een EBV infectie maar verschijnen na ongeveer twee tot vier maanden na het zien van de eerste symptomen. De antistoffen blijven levenslang in het lichaam. Soms daalt de titer tegen EBNA beneden de detectiegrens. EBNA wordt gebruikt als een soort voetspoor voor de herkenning van een actieve of latente EBV-infectie in celpreparaten of tumorcoupes.

11 Atypische lymfocyten en levertesten
Lymfocytose Atypische lymfocyten Virocyten Levertesten AST ALT 30U/L Het bloedbeeld vertoont lymfocytose met aanwezigheid van atypische lymfocyten. Als het aantal atypische lymfocyten onder de 10% van het totaal aantal witte bloedcellen ligt dan mag mononucleosis infectiosa uitgesloten worden. Virocyten zijn geactiveerde, reactieve lymfocyten die vooral aanwezig zijn bij een EBV infectie. Morfologisch zijn virocyten niet altijd gemakkelijk te onderscheiden van lymfoomcellen. Transaminasen zijn katalysatoren voor de omzetting van amino- en ketozuren. Glutamaat oxaalacetaat transaminase (GOT) of aspartaat aminotransferase (AST) komt veel voor in hart en lever, zowel in het cytoplasma als in de mitochondriën van de hart- en levercellen. Daarnaast heb je nog glutamaat pyruvaattransferase (GPT) of alanine amino-transferase (ALT). Deze komt vooral in het cytoplasma van de levercellen voor en minder in de nieren en de skelet-spieren. De lever bevat ongeveer driemaal zoveel GOT als GPT. De verhouding tussen deze twee enzymen is de maat voor de ernst van de celbeschadiging. Normale waarden van de AST en ALT zijn 30 U/l. Bij een EBV infectie zullen deze waarden stijgen. 2-3 x normaal = milde stijging 3-20 x normaal = matige stijging >20 x normaal = sterke stijging

12 Methoden Vidas VirClia

13 Vidas Half automatisch immuno-analyser ELFA Reagensstrip en SPR
De reagensstrip bevat alle benodigde reagentia zoals wasvloeistof, buffer, substraat en conjugaat. De SPR doet dienst als de vaste fase van de analyse. Bij de analyse van het Epstein-Barr virus is de SPR gecoat aan de binnenzijde met antigenen tegen het antilichaam dat opgezocht wordt. De Vidas maakt gebruik van een twee staps enzym-immunoassay of ELFA (enzyme linked fluorescent immuno Assay) test. Er zijn vier grote stappen binnen dit proces: Tijdens de tweede stap wordt het staal terug opgezogen door de SPR en naar het volgende cupje gebracht waar er verder wordt gewerkt. Nu gaan er secundaire antilichamen binden met het enzym alkalische fosfatase. Tijdens de derde stap wordt er 4-methyl-umbelliferylfosfaat (4-UMP) aan toegevoegd  het enzym hydrolyseert dit tot 4-methyl umbelliferon waardoor de fluorescentie bij 450 nm kan gemeten worden.

14 VirClia Automatische immuno-analyser CLIA
chemiluminescence immuno-assay. Chemiluminescentie is de emissie van licht via een chemische reactie. Een atoom heeft een elektron in schil n=1. Doordat het atoom energie absorbeert, gaat de elektron naar een hoger energie niveau (schil n=2). Wanneer het elektron terugvalt naar zijn originele positie, de grondtoestand, dan zal er energie onder de vorm van licht uitscheiden. Bij deze chemiluminescentie komt het elektron in een hoger energie niveau doordat luminol en peroxide reageren. 1) Tijdens de eerste stap binden antilichamen in het staal met de antigenen op het polystyreen oppervlak. Deze binding kan doorgaan als het staal de juiste antilichamen bevat en kan zo een complex vormen. Nadat er een complex is gevormd wordt er gewassen zodat de ongebonden immunoglobulines worden verwijderd. Daarna bindt een enzym gelabeld antilichaam met het antigen-antilichaam complex. Na een nieuwe wasstap wordt er substraat oplossing toegevoegd. Hierdoor kan met behulp van chemieluminiscentie de hoeveelheid licht met een luminometer gemeten worden.

15 Resultaten Intrarun Interrun 29 patiënten 10x op 1 dag
Positieve (Virotrol) en negatieve (Viroclear) controle Interrun 10x over 5 dagen 29 patiënten

16 Vidas EBNA IgG <0,1 IU/ml = negatief
0.10 ≤ titer ≥ 0.21 intermediair > 0.21 IU/ml positief Vidas EBNA IgG Intrarun PC Intrarun NC Interrun PC Interrun NC 1,82 0,00 1,95 1,92 2,09 2,02 1,88 1,98 2,04 1,86 1,96 1,93 1,76 1,73 1,89 1,83 2,08 1,65 2,03 Gemiddelde 1,85 1,994 Standaarddeviatie 0,1160 0,0740 CV 6,2676 / 3,7095

17 Vidas EBV VCA IgM <0,1 IU/ml = negatief
0.10 ≤ titer ≥ 0.21 intermediair > 0.21 IU/ml positief Vidas EBV VCA IgM Intrarun PC Intrarun NC Interrun PC Interrun NC 0,64 0,00 0,55 0,01 0,60 0,74 0,70 0,61 0,63 0,54 0,6 1,37 0,68 0,65 0,62 0,72 0,59 0,79 Gemiddelde 0,639 0,716 0,001 Standaarddeviatie 0,0303 0,2443 0,00316 CV 4,7496 / 34,1232

18 VirClia EBNA IgG Kalibratie >2,0 - x - < 7,0
Negatieve controle = < 2,0 Index = Staal RLU / kalibrator RLU <0.9 negatief, 0.9 > index < 1.1 intermediair en >1.1 positief VirClia EBNA IgG Intrarun PC Index Intrarun PC Cal Intrarun NC Index Interrun PC Index Interrun PC Cal Interrun NC Index 4,786 3,186 0,172 3,702 3,362 0,194 4,195 3,264 0,148 3,545 3,425 0,237 4,813 3,177 3,519 3,766 0,244 4,469 3,479 0,137 3,588 3,449 0,262 4,640 3,418 0,168 3,897 3,335 0,220 4,244 3,597 0,055 4,019 3,609 0,253 4,076 2,574 0,147 3,745 3,616 0,239 3,446 0,169 3,678 3,856 0,242 4,143 3,553 0,171 3,904 3,542 0,248 4,180 3,581 3,596 3,673 Gemiddelde 4,3741 3,3275 0,1462 3,7193 3,5632 0,2376 Standaarddeviatie 0,2795 0,3068 0,03446 0,1703 0,1730 0,01890 CV 6,3896 9,2205 23,5684 4,5797 4,8545 7,9539 Kalibrator wordt gebruikt als controle

19 VirClia EBV VCA IgM Kalibratie >2,0 - x - < 7,0
Negatieve controle = < 2,0 Index = Staal RLU / kalibrator RLU <0.9 negatief, 0.9 > index < 1.1 intermediair en >1.1 positief VirClia EBV VCA IgM Intrarun PC Index Intrarun PC Cal Intrarun NC Index Interrun PC Index Interrun PC Cal Interrun NC Index 0,507 3,721 0,074 0,475 2,878 0,102 0,534 3,555 0,099 0,492 3,113 0,128 0,471 3,630 0,109 0,468 3,127 0,088 0,510 3,623 0,586 3,012 3,501 0,082 0,463 3,147 0,530 3,412 0,086 3,326 0,094 0,443 3,591 0,500 3,034 0,098 0,429 3,827 0,170 0,481 3,209 0,105 0,424 3,437 0,527 3,174 0,110 0,391 3,821 0,496 3,043 0,108 Gemiddelde 0,4746 3,6117 0,1002 0,5022 3,1063 0,1016 Standaarddeviatie 0,0501 0,1450 0,02708 0,0376 0,1228 0,01450 CV 10,5563 4,0145 27,0253 7,4776 3,9520 14,2722

20 Vergelijking Vidas en VirClia
Intrarun PC Intrarun NC Interrun PC Interrun NC Vidas EBNA IgG Gemiddelde 1,85 1,994 Standaarddeviatie 0,1160 0,0740 CV 6,2676 / 3,7095 Vidas EBV VCA IgM 0,639 0,716 0,001 0,0303 0,2443 0,00316 4,7496 34,1232 Intrarun PC Index Intrarun PC Cal Intrarun NC Index Interrun PC Index Interrun PC Cal Interrun NC Index VirClia EBNA IgG Gemiddelde 4,3741 3,3275 0,1462 3,7193 3,5632 0,2376 Standaarddeviatie 0,2795 0,3068 0,03446 0,1703 0,1730 0,01890 CV 6,3896 9,2205 23,5684 4,5797 4,8545 7,9539 VirClia EBV VCA IgM 0,4746 3,6117 0,1002 0,5022 3,1063 0,1016 0,0501 0,1450 0,02708 0,0376 0,1228 0,01450 10,5563 4,0145 27,0253 7,4776 3,9520 14,2722

21 Patiëntenstalen 29 patiënten Vier categorieën
18 oude infecties, 5 acute infecties, 3 onbepaalde en 3 zonder immuniteit EBV VCA IgM EBNA-1 IgG Paul-Bunell Atypische lymfocyten Interpretatie + - Acute infectie Oude infectie Onbepaald Geen immuniteit

22 Oude infectie Oude infectie Vidas EBV VCA IgM Vidas EBNA IgG
VirClia EBV VCA IgM VirClia EBNA IgG Brugge EBV VCA IgM Brugge EBNA IgG P 0,43 P 4,70 N 0,397 P 11,73 Negatief >100 U/ml N 0,10 P 6,32 N 0,172 P 7,674 >100 E 0,14 P 3,89 N 0,263 P 8,743 N 0,02 P 8,12 N 0,141 P 11,78 N 0,01 P 1,24 N 0,161 P 10,48 P 42 N 0,00 P 6,74 N 0,213 P 9,084 P 8,18 N 0,082 P 10,71 P 3,78 N 0,457 P 4,262 E 0,18 P 5,02 N 0,563 P 4,265 N 0,64 (1) P 16 (1) N 0,05 P 6,33 N 0,092 P 7,957 P 2,34 N 0,075 P 12,75 P 86 (1) P 3,70 N 0,104 P 10,82 P 6,66 N 0,277 P 13,54 N 0,16 (1) P 17,89 (1) P 8,31 N 0,137 P 11,52 N 0,02 (1) P 26 P 8,78 N 0,071 P 8,312 N 0,01 (1) P 4,62 N 0,123 P 8,161 N 0,05 (1) P 14 (1) P 0,40 P 7,95 N 0,140 P 8,301 N 0,3 (1) P 19 (1) P 1,79 N 0,321 P 4,979 N 0,72 (1) P 8 (1)

23 Acute infectie Acute infectie Vidas EBV VCA IgM Vidas EBNA IgG
VirClia EBV VCA IgM VirClia EBNA IgG Brugge EBV VCA IgM Brugge EBNA IgG P 2,31 N 0,07 P 2,533 N 0,667 P 28,24 (1) N 0,13 (1) N 0,01 N 0,04 P 1,804 P 12,29 P 2,75 (1) P 1 (1) P 0,45 N 0,00 P 1,247 N 0,256 P 2,62 (1) N 0,02 (1) P 0,20 P 2,063 N 0,863 Positief Negatief P 5,70 N 0,191 P 9,346 >100

24 Onbepaald en geen immuniteit
Vidas EBV VCA IgM Vidas EBNA IgG VirClia EBV VCA IgM VirClia EBNA IgG Brugge EBV VCA IgM Brugge EBNA IgG N 0,00 P 1,39 N 0,105 P 8,241 Negatief P 61 (1) N 0,08 P 0,64 N 0,762 P 2,307 P 28 (1) P 0,30 P 1,15 N 0,446 P 4,099 >100 Geen Immuniteit Vidas EBV VCA IgM Vidas EBNA IgG VirClia EBV VCA IgM VirClia EBNA IgG Brugge EBV VCA IgM Brugge EBNA IgG N 0,02 N 0,00 N 0,061 N 0,125 N 0,11 (1) N 0,01 (1) N 0,01 N 0,075 N 0,123 N 0,05 (1) N 0,03 N 0,115 N 0,240 N 0,08 (1)

25 Patiëntstalen Vidas heeft meer discordanties
VirClia scoort beter dan Vidas Vidas EBV VCA IgM (%) Vidas EBNA IgG (%) VirClia EBV VCA IgM (%) VirClia EBNA IgG (%) Sensitiviteit 70,0 100 75,0 Specificiteit 85,7 PPV 33,3 95,5 NPV 94,7 96,0

26 Discussie Gebruiksgemak voor de laborant Vidas VirClia 1 test
HAT (Hands at time) TAT (Turn around time) Minimum volume monster Vidas VirClia 1 test 36 minuten 65 minuten 12 testen 90 minuten 24 testen 120 minuten

27 Besluit CV vergelijking Patiëntenstalen Gebruiksgemak
 VirClia voldoet aan de verschillende normen en zal gebruikt worden in het laboratorium om de testen EBNA IgG en EBV VCA IgM te bepalen

28 Bedankt voor jullie aandacht!

29 Evaluatie van EBV VCA IgM en EBNA IgG op Vidas en VirClia
Stijn Lefever