Optimalisatie van enzymatische testen voor de analyse van sulfiet, L-ascorbinezuur en glucose in voedsel Kürt Bultinck Biotox, Jabbeke.

Presentatie over: "Optimalisatie van enzymatische testen voor de analyse van sulfiet, L-ascorbinezuur en glucose in voedsel Kürt Bultinck Biotox, Jabbeke."— Transcript van de presentatie:

1 Optimalisatie van enzymatische testen voor de analyse van sulfiet, L-ascorbinezuur en glucose in voedsel Kürt Bultinck Biotox, Jabbeke

2 Overzicht Principe Principe Analyses Analyses Bepalingen Bepalingen Resultaten Resultaten Conclusies Conclusies Sulfiet L-ascorbinezuur of vitamine C Glucose

3 Principe Reproduceerbaarheid Reproduceerbaarheid Herhaalbaarheid Herhaalbaarheid Juistheid van de controle Juistheid van de controle Juistheid van het spiken Juistheid van het spiken Opstellen van een validatiedossier gebeurt aan de hand van:

4 Analyses 3 bepalingen met 3 verschillende matrices: Sulfiet (rotsjes, sinaasappelsap en koekjes) L-ascorbinezuur of vitamine C (pannenkoeken, sinaas- appelsap en poeder afkomstig van vitamine C- supplementen. Glucose (pannenkoeken, sinaasappelsap en confituur)

5 Bepalingen Pipetteer in een cuvet Blanco (mL) Staal (mL) Reactiemengsel 2* 1,0001,000 Staal-0,100 Demiwater2,0001,900 Oplossing 3 0,0100,010 Meng en lees de absorbanties af na ongeveer 5 minuten. Start de reactie na toevoeging van: Oplossing 4 0,0500,050 Meng en lees de absorbantie af na 30 minuten. Sulfiet

6 Bepalingen Pipetteer in een cuvet Blanco (mL) Staal (mL) Oplossing 1 (37°C) 1,0001,000 Staal0,1000,100 Demiwater1,5001,500 Spatel met ascorbaatoxidase één spatel - Meng en incubeer gedurende 6 minuten bij 37°C. Roer om de 2 minuten 5 seconden met de spatel. Lees de absorbanties af en start de reactie door toevoegen van: Oplossing 3 0,1000,100 Meng en plaats de cuvetten bij 37°C. Lees de absorbantie af na 15 minuten. Vitamine C

7 Bepalingen Pipetteer in een cuvet Blanco (mL) Staal (mL) Oplossing 1 1,0001,000 Staal-0,100 Demiwater2,0001,900 Meng en lees de absorbantie af na 3 minuten (A1). Start de reactie na toevoeging van: Oplossing 2 0,0200,020 Meng en lees de absorbantie af na 15 minuten. Glucose

8 Resultaten Sulfiet Vitamine C Rotsjes (mg/kg) Sinaasappelsap (g/L) Koekjes (mg/kg) Gemiddelde450,014750,78 Standaarddeviatie7,110,00217,14 % variatiecoëfficiënt 15,7914,2214,06 Reproduceerbaarheid Pannenkoeken (mg/kg) Sinaasappelsap (g/L) Poeder (mg/kg) Gemiddelde2704,30,117228630,9 Standaarddeviatie275,90,01591160,8 % variatiecoëfficiënt 10,2013,554,05

9 Resultaten Glucose Glucose Reproduceerbaarheid Pannenkoeken (mg/kg) Sinaasappelsap (g/L) confituur (mg/kg) Gemiddelde13727,832,36234408,3 Standaarddeviatie5282,680,036855,02 % variatiecoëfficiënt 38,481,152,92

10 Resultaten Sulfiet Vitamine C Rotsjes (mg/kg) Sinaasappelsap (g/L) Koekjes (mg/kg) Gemiddelde41,83330,013361,5 Standaarddeviatie7,170,00174,416 % variatiecoëfficiënt 17,1313,197,18 Herhaalbaarheid Pannenkoeken (mg/kg) Sinaasappelsap (g/L) Poeder (mg/kg) Gemiddelde2416,80,0929801,3 Standaarddeviatie338,770,011400,7 % variatiecoëfficiënt 14,026,114,70

11 Resultaten Glucose Herhaalbaarheid Pannenkoeken (mg/kg) Sinaasappelsap (g/L) Confituur (mg/kg) Gemiddelde13727,832,36234408,3 Standaarddeviatie5282,680,036855,02 % variatiecoëfficiënt 38,481,152,92

12 Resultaten Sulfiet Juistheid controle Theoretisch sulfietgehalte Gemeten sulfietgehalte % terugvinding Meting 1.1 0,30,29799,00 Meting 1.2 0,30,29899,33 Meting 1.3 0,30,303101,00 Meting 1.4 0,30,29899,33 Meting 1.5 0,30,29799,00 Meting 1.6 0,30,29498,00 Gemiddelde99,28

13 Resultaten Vitamine C Juistheid controle Theoretisch vitamine C- gehalte Gemeten vitamine C- gehalte % terugvinding Meting 1.1 0,20,158179,05 Meting 1.2 0,20,163281,60 Meting 1.3 0,20,160480,20 Meting 1.4 0,20,158179,05 Meting 1.5 0,20,159579,75 Meting 1.6 0,20,162481,20 Gemiddelde80,14

14 Resultaten Glucose Juistheid controle Theoretisch glucosegehalte Gemeten glucosegehalte % terugvinding Meting 1.1 0,50,494998,98 Meting 1.2 0,50,494998,98 Meting 1.3 0,50,493198,62 Meting 1.4 0,50,495799,14 Meting 1.5 0,50,5009100,18 Meting 1.6 0,50,492398,46 Gemiddelde99,06

15 Resultaten Sulfiet % terugvinding Rotsjes 1 114,03 Rotsjes 2 101,50 Gemiddelde107,77 Standaarddeviatie8,86 Koekjes 1 91,87 Koekjes 2 103,86 Gemiddelde97,87 Standaarddeviatie8,48 Terugvinding spiken Vitamine C % terugvinding Poeder 1 87,30 Poeder 2 81,97 Gemiddelde84,64 Standaarddeviatie3,77

16 Resultaten Glucose Terugvinding spiken % terugvinding Confituur 1 14,69 Confituur 2 17,82 Gemiddelde16,26 Standaarddeviatie2,22

17 Conclusies Sulfiet Reproduceerbaarheid: Te hoog, niet ok. Herhaalbaarheid: Te hoog, niet ok. Juistheid controle: Ok. Terugvinding spiken: Ok. Vitamine C Reproduceerbaarheid: Te hoog, niet ok. Herhaalbaarheid: Te hoog, niet ok, behalve poeder. Juistheid controle: Te laag, niet ok. Terugvinding spiken: Te laag, niet ok.

18 Conclusies Glucose Reproduceerbaarheid: Te hoog, niet ok. Herhaalbaarheid: Enkel sinaasappelsap ligt te hoog, voor sinaasappelsap en confituur is het ok. Juistheid controle: Ok. Terugvinding spiken: Te laag, niet ok. Externe bepaling: 1,45%  hier 1,40%  Ok.

19 Optimalisatie van enzymatische testen voor de analyse van sulfiet, L-ascorbinezuur en glucose in voedsel Kürt Bultinck Biotox, Jabbeke

20 Bestanddelen Sulfiet -Oplossing 1: triethanolaminebuffer; -tabletten NADH; -Oplossing 3: NADH-peroxidase; -Oplossing 4: sulfietoxidase. L-ascorbinezuur -Oplossing 1: Natriumfosfaat/citraatbuffer en MTT; -Ascorbaatoxidase spatels; -Oplossing 3: PMS-oplossing

21 Bestanddelen Glucose Glucose - Oplossing 1: mengsel van triethanolaminebuffer, NADP, ATP en magnesiumsulfaat; - Oplossing 1: mengsel van triethanolaminebuffer, NADP, ATP en magnesiumsulfaat; - Oplossing 2: mengsel van hexokinase en glucose-6-fosfaat dehydrogenase.

22 Wet van Lambert-Beer A=a.b.c A= absorbantie (geen éénheid)A= absorbantie (geen éénheid) a= absorptiviteit van de gekleurde stof, (L/g.cm)a= absorptiviteit van de gekleurde stof, (L/g.cm) b= dikte van de absorberende laag (cm)b= dikte van de absorberende laag (cm) c= concentratie van het te bepalen bestanddeel (g/L)c= concentratie van het te bepalen bestanddeel (g/L)

23 Formule sulfiet c= V * MW *  A ε * d * v * 1000 ε * d * v * 1000 = 3,060*64,06 *  A (g/L) = 3,060*64,06 *  A (g/L) 6,3 * 1 * 0,1 * 1000 6,3 * 1 * 0,1 * 1000

24 Formule L-ascorbinezuur c= V * MW *  A ε * d * v * 1000 ε * d * v * 1000 = 2,700*176,13 *  A (g/L) = 2,700*176,13 *  A (g/L) 16,9 * 1 * 0,1 * 1000 16,9 * 1 * 0,1 * 1000

25 Formule glucose c= V * MW *  A ε * d * v * 1000 ε * d * v * 1000 = 3,020*180,16 *  A (g/L) = 3,020*180,16 *  A (g/L) 6,3 * 1 * 0,1 * 1000 6,3 * 1 * 0,1 * 1000

26 Alternatieven bepaling L- ascorbinezuur Titratie met DCPIP-oplossing. Titratie met DCPIP-oplossing. DCPIP (2, 6-dichloorfenol-indofenol ) is in een basisch milieu blauw en in een zuur milieu rood. Door de werking van vitamine C wordt de stof gereduceerd. Er ontstaat dan een kleurloze stof. Titreren tot een rode kleur. HPLC HPLC

27 Enzymen Oxidoreductasen: enzymen die redoxprocessen katalyseren. Transferasen: deze enzymen katalyseren de overdracht van een bepaalde functionele groep van de ene molecule naar de andere. Hydrolasen: veroorzaken een hydrolytische splitsing (onder invloed van water) Lyasen: katalyseren additiereacties aan dubbele bindingen. Isomerasen: katalyseren omleggingen in de moleculen zelf. Ligasen: veroorzaken een binding tussen twee moleculen, meestal gekoppeld aan de hydrolyse van een ATP molecule. Kinasen: katalyseren de transfer van een fosfaatgroep uit ATP naar een substraat.