De PCR reactie

PCR = Polymerase Chain Reaction Een snelle, (vrij) goedkope, methode waarmee in korte tijd (paar uur) een bepaald stuk DNA (of RNA) in vitro miljoenen keren vermenigvuldigd kan worden. De PCR reactie lijkt erg op de replicatie van DNA zo als die in de natuur plaatsvindt

De PCR reactie werd in 1983 door Kary Mullis ontwikkeld Kary Mullis kreeg voor de ontwikkeling van de PCR in 1993 de Nobelprijs voor Chemie Het idee is simpel: 1: Maak het ds DNA ss 2: Laat op elke streng een primer annealen (binden) (= startpunt voor DNA Polymerase) 3: Laat DNA polymerase de primers verlengen zodat er twee ds DNA strengen ontstaan Herhaal de stappen 1, 2 en 3 20 – 40 x

Hoe maak je DNA enkelstrengs?????? Het idee is simpel: -Maak het ds DNA ss Laat op elke streng een primer annealen (binden) Laat DNA polymerase de primers verlengen zodat er twee ds DNA strengen ontstaan Herhaal deze stappen 20 – 40 x Hoe maak je DNA enkelstrengs?????? Door de temperatuur sterk te verhogen. Hierdoor zullen de waterstofbruggen tussen de stikstofbasen verbroken worden NB. Er zijn andere manieren om DNA ss te maken: sterk zuur base ureum Dit proces wordt denaturatie genoemd. Het proces is (onder bepaalde omstandigheden) reversibel Van ss DNA naar ds DNA wordt renaturatie genoemd

Laat op elke streng een primer annealen (binden) Voorwaarde om de primers perfect te laten hybridiseren is dat de nt volgorde van het te vermenigvuldigen (stuk) DNA bekend is. Het idee is simpel: - Maak het ds DNA ss Laat op elke streng een primer annealen (binden) Laat DNA polymerase de primers verlengen zodat er twee ds DNA strengen ontstaan Herhaal deze stappen 20 – 40 x

Het idee is simpel: Maak het ds DNA ss Laat op elke streng een primer annealen (binden) Laat DNA polymerase de primers verlengen zodat er twee ds DNA strengen ontstaan Herhaal deze stappen 20 – 40 x

Het idee is simpel: Herhaal deze stappen 20 – 40 x Maak het ds DNA ss Laat op elke streng een primer annealen (binden) Laat DNA polymerase de primers verlengen zodat er twee ds DNA strengen ontstaan Herhaal deze stappen 20 – 40 x Bij herhaling van de 3 stappen zijn er dus steeds meer DNA strengen als matrijs beschikbaar!!! - Het gemaakte DNA fragment (PCR product) wordt ookwel amplicon of amplimeer genoemd.

De PCR reactie Het denatureren van het DNA gebeurt bij ± 94 °C, 20 – 30 seconden is vaak al genoeg. De primer annealing vindt meestal plaats bij een temperatuur die tussen de 50 en 60 °C inligt ( De synthese vindt plaats bij 72 °C. De tijdsduur is afhankelijk van de lengte van het te synthetiseren DNA.

Bijn de PCR vindt dezelfde reactie plaats als bij de synthese van de leading streng tijdens de replicatie (1 primer waarna het DNA polymerase een complementaire streng tegenover de matrijs maakt).

De eerste PCRs die door Kary Mullis werden uitgevoerd waren nog wat “ primitief “ (1) Het epje waarin de PCR werd uitgevoerd werd handmatig van het ene waterbad naar het andere getransporteerd. Nu zijn er apparaten waar het epje in gezet kan worden en waar de temperatuur automatisch veranderd.

De eerste PCRs die door Kary Mullis werden uitgevoerd waren nog wat “primitief” (2) Het DNA Polymerase dat werd gebruikt was afkomstig van E.coli. De optimale temperatuur van dat enzym bedraagt 37 °C. Na iedere cyclus moest nieuw DNA polymerase worden toegevoegd omdat het enzym door de hoge temperaturen werd geinactiveerd. De oplossing betrof de vondst van een thermostabiel DNA polymerase in een bacterie die in heetwaterbronnen leeft. Uit Thermophilus aquaticus kon men het Taq polymerase isoleren. Dit polymerase werkt optimaal bij 75 – 80 °C, en hoeft maar 1 keer aan de reactiemix te worden toegevoegd.

Per PCR cyclus wordt het DNA een factor 2 vermenigvuldigd. Na 20 cycli is dat….. 220 = 1.048.576 x Na 25 cycli is dat…. 225 = 33.554.432 x De vermenigvuldigingsfactor is onder ideale omstandigheden in principe 2n.

Is de PCR verlopen zoals je deze had geprogrammeerd? Van het verloop van alle stappen van de PCR kan een zogenaamd temperatuurprofiel gemaakt worden. Het temperatuurverloop in een epje wordt dan weergegeven afgezet tegen de tijd.

Het temperatuurprofiel van een PCR meer in detail Op deze manier is duidelijk welke temperatuur is bereikt en hoe lang dat heeft geduurd. De tijd die nodig is om van de ene T naar de andere te komen wordt de ramp tijd genoemd.

Hoe weet je dat de PCR gelukt is?????? Hoe weet je of er een PCR product is gemaakt??? Hoe weet je of dat het correcte product is????? Na de PCR kan een deel van het reactiemengsel in een agarosegel ge-electroforeerd worden.