Replicatie van de telomeren BIO 42 Replicatie van de telomeren Sequencen RFLPs en SSRs

Telomeren Telomeren bevatten lange stukken met repetitief DNA telomeer

Telomeren

DNA polymerase in actie

Replicatie van de telomeren Per replicatie van het DNA wordt er een stukje telomeer niet verdubbeld!!! De lengte van de telomeren varieert per persoon. Bij de conceptie is de gemiddelde lengte 20.000 bp, bij de geboorte 11.000 bp. 20 jaar : 8000 bp, 50 jaar 7000. Het verlies is 50 – 100 bp per jaar.

Replicatie van de telomeren Tijdens de replicatie wordt de RNA primer verwijderd. Er blijft daardoor aan de 5’-uiteinden van het DNA een gap over, een enkelstrengs - stuk DNA. Dit stukje ss DNA kan in de meeste cellen nooit meer dubbelstrengs gemaakt worden!!!!!! Het gaat om de telomeren van de chromosomen die daardoor steeds korter worden.

Verlenging van de telomeren. In bepaalde cellen (voortplantingscellen, stamcellen en .. ........ is het enzym telomerase actief = een enzym dat de telomeer-uiteinden kan verlengen.

Verlenging van de telomeren. Telomerase is een eiwit-RNA complex met een reverse transcriptase werking.

Verlenging van de telomeren. Telomerase is een eiwit-RNA complex met een reverse transcriptase werking.

De volgorde van de nucleotide sequentie bepalen. sequencen De volgorde van de nucleotide sequentie bepalen.

De meest gebruikte methode is de sequentiemethode van dhr. Sanger Frederick Sanger Born: 13-Aug-1918Frederick Sanger Birthplace: Rendcombe, Gloucestershire, England Died: 19-Nov-2013 2 x de Nobelprijs 1958 en in 1980

De Sanger sequence methode is een methode waarbij een nieuwe DNA-streng wordt gemaakt. Bij die synthese worden naast de gewone dNTPs ook speciale nucleotiden gebruikt, de zg. dideoxynucleotiden Het principe van de sequentiemethode is de synthese van een nieuwe DNA streng op ss DNA…..dus DNA synthese in vitro. De synthese wordt op willekeurige plaatsen beëindigd door deze speciale dideoxynucleotiden.

De binding van de nieuwe nucleotide in de gewone replicatie Nieuwe covalente band (fosfo- di-ester binding) dNTP dNMP

De ddNTP vergeleken met de dNTP Voor de synthese van DNA is nodig: -een matrijs -een stukje ds DNA -een vrij 3’-OH uiteinde aan de laatste nucleotide Na inbouw van een dideoxynucleotide kan de synthese dus niet verder!!!

Replicatie met dNTPs en ddNTPs De synthese van de nieuwe DNA streng met dNTPs en ddGTP geeft bv. bovenstaand resultaat Dezelfde reactie wordt in aparte epjes uitgevoerd op hetzelfde DNA met ddATP, ddCTP en ddTTP

DNA sequencing Tijdens de synthese wordt een label ingebouwd zodat het nieuw gesynthetiseerde DNA te onderscheiden is van het originele DNA en te zien is!!! Het label kan aan de primer zijn gebonden of Aan een nucleotide; bv. aan dCTP dCTP, [α-32P]-

Voorafgaand aan de electroforese wordt het DNA gedenatureerd en ook de acrylamide gel bevat een denaturerend stofje. Waarom????????

Sequencen met fluorescerende labels Elke ddNTP heeft zijn eigen fluorescerende label. De synthese van het nieuwe DNA kan daardoor in 1 epje plaatsvinden De electroforese kan daardoor ook in 1 epje plaatsvinden Een voorbeeld van een sequentiegel ziet er dan als volgt uit.

Sequencen met fluorescerende labels kan automatisch

RFLP RFLP = het verschil in lengte van DNA fragmenten wat ontstaat na knippen met een RE RFLP = Restrictie Fragment Lengte Polymorfisme RE-knipsites puntmutatie duplicatie na knippen gelelectroforese RFLP’s ontstaan door een: - puntmutatie - insertie - deletie - duplicatie

RFLPs kunnen we gebruiken om ziektes aan te tonen. Ziektes die je op deze manier aantoont zijn monogene ziektes; veroorzaakt door 1 gen. Ziektes als diabetes, reuma, psychiatrische aandoeningen zijn voorbeelden van polygene ziektes.

Sikkelcelanemie is ook aan te tonen met RFLPs bij sikkelcelanemie ligt de puntmutatie in een herkennings- plaats (site) voor het restrictie enzym MstII ! 5’ – CCTNAGG – 3’ kb = kilobaseparen = 1000 baseparen

3% = Simple sequence repeats SSRs zijn 1 – 3 nt die duizenden keren worden herhaald (Er zijn nog veel andere vormen van repeterend DNA) In deze repeterende gebieden kan het gebeuren dat het DNA polymerase “slipt”. Hierdoor komt het vrij vaak voor dat het aantal “repeats” per persoon verschilt!!!! Dit noemt men polymorfisme…… of VNTR = Variabel Number of Tandem Repeats

VNTRs zijn erfelijk Een kind heeft altijd een combinatie van VNTRs van de moeder en van de vader. P = parent F = filus = kind = volgende generatie

De erfelijkheid van VNTRs in beeld gebracht Bij ieder kind is het VNTR -patroon een combinatie van bandjes van de beide ouders. Een aantal kinderen hebben hetzelfde patroon Wat moet je doen om alle kinderen van elkaar te onderscheiden??? man “getrouwd” vrouw Kinderen, eerste kind staat links

Repetitief DNA Repetitief DNA kan gebruikt worden om de afkomst van DNA te achterhalen (bv. bij een moordzaak) Er wordt een PCR uitgevoerd waarbij meerdere repetitieve stukken DNA worden vermeerderd.

Hoe kom je aan materiaal om een dergelijke proef te doen??? DNA Evidence Is Left Behind In A Variety Of Forms A skin cell, blood, and the shaft of a hair (shown from left to right) all contain DNA and can be collected as crime scene evidence. (Microscopic images of the skin cell and hair shaft courtesy of Joseph A. Brzostowski)

Een overzicht van het experiment Omdat het om zeer kleine hoeveelheden kan gaan wordt vaak nog gebruik gemaakt van een vermenigvuldigings stap: De PCR reactie.

Een voorbeeld van het gebruik van een DNA fingerprint om vast te stellen wie de dader is. I.p.v. PCR kunnen de VNTRs aangetoond worden door met restrictie enzymen te knippen. Er ontstaan dan RFLPs.

Persoonlijke DNA profielen

Injustice Corrected It takes both sequences at all 13 sites to prove a DNA match, ………. but it only takes one sequence to prove a mismatch. DNA evidence has been used to liberate a growing number of people who were falsely imprisoned for crimes they did not commit.