Kwaliteitscontrole op (recombinante) proteïnen Ten einde (recombinant) proteïne als GM op de markt te krijgen Biochemische en biofysische eign goed gekend, als basis voor reproduceerbaarheid, stabiliteit, onzuiverheden, …

Structuur van proteïnen Primaire structuur : AZ-sequentie SLIDE (proteine structuur) Uit primaire struct kan afgeleid worden wat de lading vh proteïne zal zijn, evenals zijn IEP, MW, ext coeff, hydrofobiciteit… Posttranslationele glycosylatie, fosforylatie is heel bel Primaire structuur bepalend voor uiteindelijke 3D structuur.

Eiwitten - AZ - peptidebinding

Structuur van proteïnen Secundaire structuur : a-helix: door waterstofbrug vorming tussen de amide en carbonyl groep van elk vierde AZ risidue ZIE SLIDE b-sheet: door waterstofbrug vorming tussen AZ verder van elkaar gescheiden, parallel of anti-parallel ZIE SLIDE “Loops” en “Turns” verbinden de lineaire structuren met elkaar

Structuur van proteïnen Tertiaire structuur : Combinatie van alle secundaire structuren in één 3D structuur, mogelijkheden zijn beperkt 3D structuur bepaalt functie Kwaternaire structuur: Combinatie van meer dan 1 proteïne

Proteine folding Eiwitten aangemaakt in prokaryoten vormen dikwijls inclusie-lichamen, waarin de eiwitten afgezet worden als onoplosbare eiwitten daarom is een in-vitro refolding nodig eerst solubiliseren in denaturanten als SDS, ureum, guanidine HCl daarna deze denaturanten verwijderen (vb door verdunning) => refolding prokaryoten maken ook geen disulfide bindingen, daarom achteraf oxideren (lucht, glutathion)

Posstranslationele glycosilatie Recombinante proteinen die aangemaakt worden in eukaryotische cellen en gesecreteerd worden in het medium zijn meestal gevouwen zoals de natieve proteinen. Eveneens ondergaan ze versch niveaus van glycosilatie afh van de cel lijn en expressieniveau.

Technieken om structuur te karakteriseren Alle hier vermelde technieken hebben nood aan ZUIVER proteine (gn stabiliteits of zuiverheidsonderzoek) Circulair dicroisme (CD), fluorescentie en fourier transform IR (FTIR) CD far UV : a-helix info, geen goede b-info FTIR: goede b-info, minder goede a-helix info CD near UV en fluorescentie: info over aromatische AZ (tryptofaan, tyrosine, phenylalanine) Zijn geen axacte technieken, wel X-stralen kristallografie en NMR

Circulair dichroisme Circulair dicroisme (CD): verschil in absorptie tussen links en rechts gepolariseerd licht.

Circulair dichroisme Circulair dicroisme (CD): is niet hetzelfde als optische rotatie. Wel is er bij CD een OR component. Ongeveer 0.1 mg zuiver proteine nodig Elke secundaire structuur – specifiek CD spectrum Vergelijken spectrum met natuurlijk voorkomend proteine

Circulair dichroisme

Proteïne stabiliteit Een correct gevouwen proteïne blijft niet noodzakelijk in die 3D structuur. Prot. Zijn zowel chemisch als fysisch niet stabiel. Mogelijke chemische reacties en detectie ervan zijn weergegeven in tabel Fysische stabiliteit wordt bepaald door: N <=> D => Aggregatie (= irr. denaturatie) Gu k

Analytische technieken Blotting technieken: kunnen heel kleine hoeveelheden detecteren in een mengsel proteine immobiliseren op membraan (nitrocellulose, nylon) Proben met reagens specifiek voor molecule van interest (vb Ab tegen proteine) dot-blot of slot-blot Proteinen eerst fractioneren met polyacrylamide gel electrophorese (Western blot), bepalen van afbraak producten en quantificatie immunoblotting (met Ab)

Blotting

Analytische technieken Blotting technieken: detectie: radioactief => op fotografische plaat HRP of AP => kleurvorming of chemoluminiscentie evetueel secundair Ab met label Immunoassays: ELISA: quantificatie van specifiek eiwit zie fig

Analytische technieken Electroforese Polyacrylamide gel electroforese IEF zie proteomics capillaire electroforese

Analytische technieken Chromatografische technieken: Size exclusion chromatografie: quantificatie en afbraakproducten (zie figuur) Reversed phase HPLC: op basis van hydrofobiciteit ook peptide patroon na digestie, identificatie, afbraakproducten, zuiverheid. Ion exchange chromatography: op basis van lading, zuiverheid en afbraakproducten

Analytische technieken massa spectrometrie (idem als voor proteomics): identificatie, quantificatie, zuiverheid, afbraakproducten

Bioassays In vivo: toedienen aan een proefdier en effect bestuderen In vitro: activiteit op een cel-lijn vb thymidine incorporatie (proliferatie), aanmaak van een bep cytokine (ELISA), …

Lijst van biotech GM (rec eiwitten) Zie overheads