DNA-amplificatie: PCR Amplicon-detectie: gelectroforese PCR MOLGEN2 Analysetechnieken DNA-isolatie DNA-amplificatie: PCR Amplicon-detectie: gelectroforese Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR Wat is PCR? Staat voor Polymerase Chain Reaction PCR analyse1 PCR Wat is PCR? Staat voor Polymerase Chain Reaction Ontwikkeld door de Amerikaan Karry Mullis (1983). Nobelprijs gekregen. Wat doet PCR? Gedeelte van het (deels) bekende genoom vermeerderen (miljarden kopieen) Toepassingen: snelle detectie van ziekteverwekkers, genen, afwijkende DNAfragmenten etc. Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1 Leidt tot: We zoeken het rode gen: ..AGCGCGCGCTTTCTCCTCGATCAGTCATCG.. ..TCGCGCGCGAAAGAGGAGCTAGTCAGTAGC.. We willen een techniek die alleen het rode gen doet verdubbelen en niet ál het DNA: ------------AGTA CGCT----------- Leidt tot: TCGCGCGCGAAAGAGGAGCTAGTCAGTA CGCTTTCTCCTCGATCAGTCATCG Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1 En dat leidt tot: ..AGCGCGCGCTTTCTCCTCGATCAGTCATCG.. TCGCGCGCGAAAGAGGAGCTAGTCAGTA CGCTTTCTCCTCGATCAGTCAT CGCTTTCTCCTCGATCAGTCATCG GCGAAAGAGGAGCTAGTCAGTA ..TCGCGCGCGAAAGAGGAGCTAGTCAGTAGC.. Na 40 stappen heb je ca 2^40 van dit soort fragmenten. Module: PCR analyse en Gelelectroforese

Deze methode verlangt een paar ingredienten: PCR analyse1 De Techniek. Deze methode verlangt een paar ingredienten: Er is maar heel weinig DNA nodig. Aanwezige primers (stukjes DNA van 20 bp lang). Losse nucleotiden (een mengsel van dNTP’s) DNA-polymerase (Hittebestendige versie van het enzym dat nucleotiden aan het enkele DNA vasthecht) Omgevingsfactoren (MgCl2) , Water ed. Module: PCR analyse en Gelelectroforese

Deze drie stappen herhaal je 30-40x. PCR analyse1 Hoe werkt het principe? Bij hoge temperatuur smelten de DNA strengen en raken uiteen (98 graden C) Dan hechten zich korte apart vervaardigde stukjes enkelstrengs DNA (zgn primers) (bij een bepaalde temp. Hierna koppelt DNApol er losse nucleotiden aan, en maakt de nieuwe strengen af. Deze drie stappen herhaal je 30-40x. Tenslotte koelt het geheel weer af,en heb je enorme hoeveelheid van gekopieerd fragment DNA. Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1 1a gewone dubbelstrengs DNA 1b DNA Smelt bij 98 graden 1c bij ca 50 graden hechten primers 1d bij 72 graden worden deze aangevuld met losse nucleotiden door enzym Taq-DNApolymerase (Taq -= Thermo aquatic) 2b Opnieuw smelt bij 98 graden Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1 2c bij ca 50 graden hechten primers 2d Polymerase knoopt er opnieuw losse nucleotiden aan en verlengt de streng tot het einde. (Bij 72 graden) 3b Opnieuw smelt bij 98 graden voor ronde 3…. Etc etc etc.. Module: PCR analyse en Gelelectroforese

Het aantal grote strengen blijft gelijk PCR analyse1 Wat valt op? Elke ronde verdubbelt het aantal korte fragmenten. Dus na 40 rondes heb je in principe 240 fragmenten. Het aantal grote strengen blijft gelijk Het aantal ‘halve’ strengen neemt elke stap lineair toe. Na 40 ronden is het aantal korte fragmenten dermate talrijk dat zij voor het blote oog kunnen worden aangetoond. (Gel-electroforese). Module: PCR analyse en Gelelectroforese

Wat is de werkwijze in de praktijk? PCR analyse1 Wat is de werkwijze in de praktijk? We moeten DNA zien te halen uit de cellen van het organisme dat we onderzoeken. (plant) Hiervan is maar heel weinig DNA nodig We voegen de ingredienten voor replicatie toe: water DNA-nucleotiden primers Taq-DNA-polymerase (enzym) zouten ed. Dit mengsel doorloopt een herhaald traject van temperaturen (98 graden, 50 graden, 72 graden). Tenslotte is het mengsel verrijkt met korte fragmentjes. (Zó talrijk dat de rest nauwelijks meetelt..) Module: PCR analyse en Gelelectroforese

Epje 0.2 ml met verdunningsbuffer Voeg 2 mm2 blad toe PCR analyse1 Epje 0.2 ml met verdunningsbuffer Voeg 2 mm2 blad toe Crush met pipetpunt Centrifugeer Neem supernatant over in schoon epje Voeg toe: Primers dNTP’s, Mgcl2 mengsel DNA polymerase Water En dan….IN DE PCR! Module: PCR analyse en Gelelectroforese

Ruimte voor de epjes (0.2 ml) 96 stuks maximaal PCR analyse1 PCR: Techne CYCLOGENE Verwarmd deksel Ruimte voor de epjes (0.2 ml) 96 stuks maximaal Aparte instructie aanwezig. Bedieningspaneel Ruimte voor 96 epjes Verwarmd deksel voorkomt verdamping. Module: PCR analyse en Gelelectroforese

Dit type practicum EIST dat je je volledig voorbereid. PCR analyse1 Zorg dat je alles bij de hand hebt. Centrifuge Pipetten Puntjes Rekje voor epjes Chemicalien Handschoenen Stift Afvalvat Tissues Vortex/shaker Dit type practicum EIST dat je je volledig voorbereid. Module: PCR analyse en Gelelectroforese

Methode: Men maakt een gel van agarose (soort zeewierextract) PCR analyse1- deel GELELECTROFORESE Electroforese DNAfragmenten zijn negatief geladen en zullen in een electrisch veld van MIN naar PLUS bewegen. De grootte van de fragmenten bepalen de migratiesnelheid. Grote langzaam, kleine snel! Methode: Men maakt een gel van agarose (soort zeewierextract) Hierin worden kuiltjes/welletjes aangebracht. De hele gel gaat in een buffer, waarmee ook de gel gemaakt is. Na 1-2 uur ‘runnen’ zullen de diverse DNA fragmenten zich scheiden op basis van hun grootte. Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1- deel GELELECTROFORESE Het ‘home-made’ electroforese-bakje. De gel ligt verhoogd Links en rechts aansluitingen Ernaast ligt het kammetje dat wordt gebruikt om tijdens het stollen van de gel de kuiltjes (welletjes) te maken. In één welletje past ca 30 uL. Hiernaast de bak aangesloten op 100 volt. Deze gel is bijna halverwege: de kleuren verraden hoevér je bent. Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1- deel GELELECTROFORESE Deze gel is bijna halverwege: de kleuren verraden hoevér je bent. Agar is niet geschikt. Te grof en de zaak wordt diffuus. Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1- deel GELELECTROFORESE: het resultaat Welletjes Ruler bandje Let op: de ruler 50bp, de helderheid van bandjes. Module: PCR analyse en Gelelectroforese

THUIS: NALEZEN op www.rshbiologie.nl (noteer ff) PCR analyse1 Verder nog: THUIS: NALEZEN op www.rshbiologie.nl (noteer ff) En dan onder de tweede pagina: module MOLGEN2 Download de leerlinghandleiding en zoek het PCR-practicum op. NU: PRACTICUM met de pipetpunten…. Module: PCR analyse en Gelelectroforese

OEFENEN met PIPETPUNTJES. Neem een kleine en een grote pipetpunt PCR analyse1 OEFENEN met PIPETPUNTJES. Neem een kleine en een grote pipetpunt Neem oom één klein epje mee. (mini reageerbuis + dekseltje). Dip deze in de blauwe vloeistof. Door met je vinger op de bovenkant te drukken, kan je minihoeveelheden vloeistof eruit drukken. Da’s voor PCR precies genoeg!! Module: PCR analyse en Gelelectroforese

PCR analyse1 Module: PCR analyse en Gelelectroforese

Je hebt ca 0,5 uL primer A nodig Je hebt ca 0,5 ul primer B nodig PCR analyse1 Het recept voor PCR.. Je hebt ca 0,5 uL primer A nodig Je hebt ca 0,5 ul primer B nodig Je hebt ca 0,5 uL DNAPOLYMERASE nodig. (doe ik..) Je hebt een beetje DNA uit je aardappel nodig (0,5 uL) Aanvullen met 10 uL PCR-MIX En DNAse vrij water (8 uL). Al deze hoeveelheden zijn samen slechts 20 ul. Module: PCR analyse en Gelelectroforese