serologische systematiek moleculaire systematiek Van artificieel klasseren naar fylogenetische reconstructie Historische ontwikkeling van de systematiek 5. Ontwikkelingen in de twintigste eeuw karyosystematiek chemotaxonomie serologische systematiek moleculaire systematiek experimentele systematiek numerieke taxonomie cladisme

Plantae quae genere conveniunt etiam virtute conveniunt; quae ordine naturali continentur, etiam virtute proprius accedunt; quaeque classe naturali congruunt, etiam viribus quodammodo congruunt Linnaeus 1751 Philosophia botanica

Stegobium paniceum

Taxonomische voorkeur Brassicaceae Asteraceae Campanulaceae …. Parasieten en herbivoren hebben een welbekende selectieve keuze Stegobium paniceum

De befaamde Botanische Tuin van Buitenzorg had een paviljoen voor bezoekers waar zowat alle toenmalige vermaarde biologen hebben verbleven (Haeckel, …) Kigelia planata & Victoria

Maurits Greshoff Eerste verslag van het onderzoek naar de plantenstoffen van Nederlandsch-Indië Mededeelingen uit 's Lands Plantentuin 7 Batavia: Landsdrukkerij, 1890. 1909 “Strictly speaking one might demand that every accurate description of a genus or a new species should be accompanied by a short ‘chemical description’ of the plant.” Military dispenser; Pbytochemist of the Botanic Gardens at Buitenzorg, 1888-92 (1891-92 chief of the Pharmacological Laboratory); father of systematic scientific investigations on the chemical properties of Indonesian plants. In 1895 he was appointed Assistant at the Colonial Museum at Haarlem, of which institution he was director from 1901. Author of many papers on the use and history of economic plants, fish-poisons, etc.1 Canarium greshoffi Koord. was named after him. Systematisch vergelijkend onderzoek van inhoudsstoffen

glyceriden met hoger joodgetal J.B. Mc Nair 1935 Angiosperm phylogeny on a chemical basis Bulletin of the Torrey Botanical Club 62: 515 “Plants can be classified chemically in accordance with the substances made by them. Such a chemical classification may be compared with or used as a supplement to morphological classification and may be of some importance in the true natural system of angiosperm phylogeny.” In een belangwekkende reeks van publicaties van 1917 tot 1945, poogde Mc Nair eveneens als een der eersten een verband te leggen tussen de systematiek en de vergelijkende fytochemie. In een in 1935 gepubliceerd overzichtswerk (Angiosperm phylogeny on a chemical basis) poogde hij alkaloïden, glyceriden (vetten, oliën, wassen) en vluchtige oliën als taxonomisch hulpmiddel te gebruiken: “Plants can be classified chemically in accordance with the substances made by them. Such a chemical classification may be compared with or used as a supplement to morphological classification and may be of some importance in the true natural system of angiosperm phylogeny.” Net zoals in de morfologie maakte hij onderscheid tussen primitieve en afgeleide chemische kenmerken. Hij postuleerde dat bij geëvolueerde planten de chemische bestanddelen bestaan uit grotere moleculen, en de glyceriden een hoger joodgetal hebben. Deze feiten paste hij toe op de stelling dat houtachtige planten primitiever zijn dan kruidachtige, ─ dat Magnoliaceae en Berberidaceae primitiever zijn dan Ranunculaceae. Later kwam Mc Nair tot dwepende veralgemingen m.b.t. welke chemische kenmerken van planten primitief zijn en welke afgeleid. Hij was echter zeker correct in het beklemto­nen van de rol die de vergelijkende fytochemie in de systematiek kan spelen. primitief afgeleid grotere moleculen glyceriden met hoger joodgetal

vooral secundaire metabolieten Na WO II ontwikkeling van analytische technieken in de organische chemie (chromatografie, UV en IR resonantie, NM resonantie en massaspectroscopie). “Chemotaxonomie” vooral secundaire metabolieten Na de tweede wereldoorlog werd de brug tussen de fytochemie en de systematiek definitief geslagen en kristalliseerde de chemotaxonomie tot een eigen discipline. De dan groeiende interesse voor de chemotaxonomie moet natuurlijk in verband worden gebracht met de ontwikkeling van analytische technieken in de organische chemie (chromatografie, UV en IR resonantie, NM resonantie en massaspectroscopie). Een culminatiepunt was de publicatie van het chemotaxonomische standaardwerk van Hegnauer (1962‑1996). Hij betracht een globaalbeeld op te hangen van de chemische kenmerken van de plantenfamilies - van Thallophyta tot Angiospermae. Een ander praktisch overzichtswerk in woordenboekvorm is van Harborne & al.(1999). Hegnauers overzicht behandelt niet enkel de zogenaamde secundaire stofwisselingsproducten. Ook de membraan‑ en reservestoffen en de minerale stofwisseling tonen veel groepsgebonden eigenheden. De anatomie heeft voor deze stoffen vanouds interesse betoond, en de biochemicus kan via de anatomische literatuur een eerste inzicht verwerven in chemische bijzonderheden. Het ontbreken van zetmeelkorrels bijvoorbeeld wijst op het opslaan van koolhydraten onder andere vormen.

Chemotaxonomie der Pflanzen. Hegnauer R. (1962‑1996) Chemotaxonomie der Pflanzen. Ein Ubersicht über die Verbreitung und die systematische Bedeutung der Pflanzenstoffe. 11 delen (incl. Nachträge & Generalregister). Bazel & Stuttgart, Birkhäuser. Persbericht 48 Universiteit Leiden (21 mei 2001)  Op 19 mei verschijnt het laatste deel van het omvangrijke seriewerk "Chemotaxonomie der Pflanzen" van de hand van Professor Robert Hegnauer en zijn echtgenote Minie Hegnauer-Vogelenzang. Dit deel gaat over de inhoudstoffen bij de zeer soortenrijke familie der Vlinderbloemigen, waartoe onder andere bonen en andere peulvruchten behoren. Het project dat resulteerde in meer dan 8000 pagina's drukwerk heeft dan precies 40 jaar geduurd en is van enorme betekenis in de plantkunde, farmacie en scheikunde. Professor Hegnauer (geb. 1919 in Zwitserland) werd in 1952 benoemd als Hoogleraar Pharmacognosie aan onze universiteit. In 1962 volgde zijn benoeming tot Hoogleraar in de Experimentele Plantensystematiek – een taak die hij vervulde tot zijn emeritaat in 1979. Ook na zijn emeritaat bleef Hegnauer aktief betrokken bij het wel en wee van jonge collega’s en promovendi. Zijn grote wetenschappelijke verdiensten werden internationaal erkend. Zo ontving hij o.a. eredoctoraten aan de ETH Zürich (1971) en de Universiteit van Utrecht (1987), en prestigieuze prijzen en erelidmaatschappen van een aantal internationale wetenschappelijke genootschappen. De Universiteit Leiden eert Hegnauer nu bij de verschijning van het laatste deel van zijn levenswerk met de erepenning die in het lustrumjaar 2000 ontworpen is voor personen die zich op bijzondere wijze hebben ingezet voor Wetenschap en Samenleving. Met zijn onafgebroken inzet voor de serie "Chemotaxonomie der Pflanzen" heeft Hegnauer zich inderdaad als wetenschapper zeer verdienstelijk gemaakt voor de samenleving, want mens (en dier) zijn voor hun bestaan geheel afhankelijk van door planten geproduceerde inhoudstoffen.

Rolf Dahlgren (1932-1987)

Evolutie van de secundaire plantenstoffen = coëvolutie met herbivoren

chemische verdediging tegen herbivoren secundaire metabolieten (toevalsproducten?) worden chemische wapens Asteraceae: veel isoprenoïde verbindingen Achtergrond van de grote differentiatie van de angiospermen: coëvolutie met herbivoren Bv. pyrethrolon (‘pyrethrum’ of ‘pyrethrine’) uit Chrysanthemum roseum & Tanacetum cinerariaefolium

serologische systematiek moleculaire systematiek Van artificieel klasseren naar fylogenetische reconstructie Historische ontwikkeling van de systematiek 5. Ontwikkelingen in de twintigste eeuw karyosystematiek chemotaxonomie serologische systematiek moleculaire systematiek experimentele systematiek numerieke taxonomie cladisme

Serologische systematiek en aanverwante domeinen Vergelijkend onderzoek van eiwitstructuren Electroforese Serologie Sequentieanalyses

Elektroforetisch onderzoek van eiwitten Isozymstudies Elektroforetisch onderzoek van eiwitten werd vooral toegepast om de genetische variatie van populaties te achterhalen: men gebruikt een selectie aan enzymen (GOT, ADH, PGM ...) als genetische merktekens. De onderzoeksmethode is gebaseerd op het voorkomen van zogenaamd enzympolymorfisme: veel van deze eiwitten komen voor met varianten - omdat hun polypeptide­constituenten gecodeerd worden door meer dan één genlocus (iso-enzymen of isozymen[1] of iso-enzymen), of - omdat ze gespecifieerd worden door verschillende allelen op eenzelfde genlocus (allozymen). Deze enzymstudies zijn snel en op grote schaal uitvoerbaar. De enzymen worden geëxtraheerd, voor zaadplanten vaak uit zaden. Daarna vergelijkt men hun elektroforetische mobiliteit bij taxon A, B, ... N. De primaire evidentie van variatie in populaties wordt geleverd door kleurband­jes in een zetmeelkolom of op een acrylamidegel. De werkwijze is een krachtig taxonomisch hulpmiddel precies door de directe relatie tussen de bandjes en de nucleotidesequentie van de genen. De gegevens zijn precies en kunnen goed gekwantifi­ceerd worden. Ze worden dan ook meestal verwerkt met de methoden van de numerieke taxonomie, vooral cluster­analyse. Deze elektroforeti­sche evidentie laat toe allerlei micro-evolutieve processen te onderken­nen: genetische drift, gene flow, geografische isolatie, speciatie en zo meer. Elektroforetisch onderzoek is ook op een wat hoger taxonomisch niveau relevant en laat vaak toe inzichten te verkrijgen over de verwantschappen tussen de soorten van een genus; zo hebben enzymatische analysen recent veel gegevens aan het licht gebracht over de herkomst van onze cultuurplan­ten. Het gebruik van elektroforetische evidentie in de systematiek kende een hoogtepunt in de jaren 1970. Een goede review wordt gegeven door L.D. Gottlieb (1977). In meer recente tijden is elektroforetisch onderzoek ook een belangrijk middel in de natuurbehoudswetenschap: de techniek laat toe om de genetische verarming van bedreigde soorten in kaart te brengen. [1] Indien de genetische achtergrond onbekend is wordt eveneens de term isozym gebruikt. Veel literatuur is overigens nonchalant wat betreft dit onderscheid, en gebruikt isozym in een brede betekenis (iso- s.s. + allo-). Isozyme patterns and genetic interpretation of leucine aminopeptidase found in Quercus robur. Isozymes were extracted from 35 acorn cotyledon tissues of Q robur, separated by polyacrylamide gradient gel electrophoresis and finally visualized within the gel by applying a histochemical staining method. Acorns came from a Q. robur stand in Rheinland Pfalz (Germany). A total of 13 different isozyme patterns were observed, comprising seven different isozymes. It is assumed that two different loci (Lap-A and Lap-B) code for these seven isozymes, representing four alleles at the A-locus and three alleles at the B-locus (Dankwardt and Rothe, unpubl.).

Serologisch onderzoek De serologie maakt gebruik van het vermogen van de Mammalia om afweerstoffen aan te maken in het bloed. Deze andere indirecte onderzoeksmethode van proteïnen is inderdaad gebaseerd op hun immunologische karakteristieken. Bepaalde ruimtelijke onderdelen of sequenties van een eiwitmolecule, de epitopen of determinanten, zijn verantwoordelijk voor haar serolo­gi­sche eigenschappen, namelijk de aanmaak van specifieke anti­stoffen of antibodies in het bloed van een zoogdier. Bij systematisch georiënteerd serologisch onderzoek wordt de verdeling van de epitopen van bepaalde eiwitten bij verschillende taxa onder­zocht; ze worden indirect aangetoond via hun immuunlichaampjes (paratopen of anti-determinanten) (antigen-antilichaam-reacties van klassieke serolo­gische tests). In principe zijn talloze eiwitten informatief voor de toetsing van systematische hypothesen. Bij zaadplanten heeft de praktijk uitgewezen dat de reserve-eiwitten in zaden taxonomisch bijzonder waardevol zijn. De serologische techniek stamt uit het prille begin van de twintigste eeuw, maar was in de plantkunde vooral populair van de jaren 1960 tot de jaren 1980. Ze leverde interessante resultaten op voor het beter begrip van verwant­schappen binnen grote plantenfamilies zoals Asteraceae en Solanaceae. Zie Fischer & Jensen (1992) voor een kort historisch overzicht en een voorbeeld van een recent serologisch onderzoek van de Asteraceae-Cichoroideae.

Werkwijze van serologisch onderzoek: Immuno-electroforese (IEP) Werkwijze: in het praktijk wordt het te onderzoeken proteïnen-extract ingespoten bij een proefdier. Men controleert na enige tijd het gehalte aan antibody. Er worden injecties toegediend tot wanneer het antilichaamgehalte volstaat. Dan wordt een bloedstaal afgeno­men en het antiserum geïsoleerd. Een hele reeks kwantitatieve en kwalitatieve precipitatie­methodes (serologische testen) staan ter beschikking om de antilichaam-antigenreacties te bestuderen, bijvoorbeeld immuno-elektroforese ('IEP'; figuur 7.6). Het principe van deze laatste techniek is gebaseerd op elektroforetische scheiding van de antigencomponenten, gevolgd door diffusie op een gelplaat en neerslag van de verschillende antigencomponenten met de overeenkomstige antibodies. Immuno-elektroforese. (1) De componenten van de geïsoleerde antigenen worden in het gel gescheiden door middel van een elektrisch veld. (2) Na deze elektrofore­se wordt het antilichaam-serum in een gootvormig reservoir aan het andere uiteinde van de gelplaat aangebracht. (3) antigen-componenten en antilichamen diffunderen nu zodat op de gelplaat neerslagen ontstaan waar de twee met elkaar in contact komen.

Sequentie-analysen van proteïnen Rubisco Sequentie-analysen van proteïnen In de jaren 1970 werden de aminozuursequenties van een aantal proteïnen vergelijkend onderzocht ter opheldering van de grotere verwantschappen in het plantenrijk (Boulter & Parthier 1982): daaruit resulteerden stambomen gebaseerd op de sequentie van cytochroom c, plastocyaninen, Rubisco (ribulose-1,5-bifosfaat-carboxy­lase-oxygenase), en zo meer. Structuurmodel van het enzym Rubisco

serologische systematiek moleculaire systematiek Van artificieel klasseren naar fylogenetische reconstructie Historische ontwikkeling van de systematiek 5. Ontwikkelingen in de twintigste eeuw karyosystematiek chemotaxonomie serologische systematiek moleculaire systematiek experimentele systematiek numerieke taxonomie cladisme

1953 Watson & Crick

Molecules as documents of evolutionary history 1965 Zuckerkandl & Pauling Molecules as documents of evolutionary history Journal of Theoretical biology 8: 357-366 Nucleïnezuren Sequentiebepaling Basepositie = kenmerk Kenmerktoestanden: alternatieve basen of deleties Alignering van de bepaalde sequenties = bepalen van homologie Nucleïnezuren Een volledig sequentie-onderzoek van het genoom van een organisme is een uitermate tijdrovend onderzoek. Systematiek is echter niet zozeer gebaat bij complete genoom-sequenties van een klein aantal organismen. Vergelijkend onderzoek heeft echter uitgewezen dat de sequentie van beperkte genoom­gedeelten of van kleine moleculen als 5S rRNA bijzonder veel systematische informatie leveren. Daarom claimt men vandaag dat de primaire semantiden de beste verkrijgbare fylogenetische informatie bevatten. In de jaren 1990 vertegenwoordigt de nucleïnezuur-systematiek dan ook de snelst groeiende richting van de systematiek. De bekomen sequentiegegevens kunnen zowel numeriek (fenetisch) als cladistisch verwerkt worden. Elke basepositie kan beschouwd worden als een kenmerk, waarbij de alternatieve basen of deleties van basen de toestanden vertegenwoordigen. De bepaalde sequenties moeten gealigneerd worden voor optimale weergave van hun homologie. Men heeft daarom molecules nodig met een conservatieve secundaire structuur, welke kan gebruikt worden als sjabloon bij de alignering.

DNA replicaties met alle vier terminator nucleotiden gevormde fragmenten scheiden op gel automatische omzetting van kleurcodes gel in letters van basen Mutaties en deleties zijn dan toestanden van een (genetisch) kenmerk, d.i. één positie in de DNA-keten.                                                                                                                                                                    

. Vergelijking van cpDNA restriction maps bij acht Linum soorten (IR, inverted repeat; rbcL, positie van dit gen), en cladogram bekomen na analyse ervan (uit Coates & Cullis 1987). Driehoekjes duiden kleine inserties of deleties aan ten opzichte van L. usitatissimum; het geschaduwde gedeelte beduidt een grote deletie in de L. non perenne-groep.

5S rRNA E. coli Secundaire structuur gebruikt voor optimale alignering De secundaire structuur van 5S rRNA van de coli-bacterie (uit Van de Peer 1995) en van SSU rRNA (18S) van de soja-boon (uit Nickrent & Soltis 1995). De opheldering van deze secundaire structuur heeft toegelaten sequentie­bepalingen optimaal te aligneren voor een zo getrouw mogelijke bepaling van de homologie.

cpDNA mtDNA nDNA rRNA Men gebruikt zowel DNA als verschillende RNA's, niet enkel nucleair DNA. De kleine genomen die in het midden van de jaren 1960 ontdekt werden in de mitochondriën en chloroplasten zouden al snel zeer interessant blijken voor DNA-systematiek. De taxonomische informatie vervat in de resultaten hangt af van de molecule. In andere woorden, niet alle types nucleïnezuur evolueren even snel. Het snel evoluerende cpDNA is daarom vooral geschikt voor fylogenese op niveau familie en genus, terwijl het trage rRNA hoofdzakelijk wordt gebruikt voor de studie van de fylogenese op de niveaus regnum, afdeling en klasse.

Moleculaire klok??

morfologie chromosomen collecties morfologie alfa-taxonomie secundaire stoffen chemotaxonomie cytotaxonomie morfologie chromosomen isozymstudies eiwitten serologie moleculaire systematiek NA sequenties fylogeografie biogeografie populaties experimentele systematiek