LENGTE METEN VAN EEN GENOOM Mol. Gew. E.coli genoom is 2.6 x 107 of 4.6 x 106 baseparen of 4600 KBP of 4.6 mega-baseparen. Een helix bevat 10 baseparen en is 3.4 nm lang. Lengte van de DNA draad is 4.6 x 106 x 0.34 nm = 1564 mm. Grootte cel is ongeveer 1 mm

DENATURATIE-RENATURATIE- Annealing Probe Primer Baseparing Enkelstrengig naar dubbelstrengig DNA DENATURATIE-RENATURATIE- HYBRIDISATIE

The result is a double stranded molecule organised in a double helix Note that the strands or oriented in the opposite direction The bases are connected via H-bridges: two H-bridges for the A=T pair and 3 for the G C pair

Native (Double helix) Denatured (random coil)

Melting curve: Tme

PARAMETERS VAN ZUIVER DNA 1 mg DNA per ml komt overeen met een OD260 van ongeveer 2 OD260/OD280 tussen 1.8 en 2.2 OD234/OD260 ongeveer 0.5

Comparison of prokaryotic cells and eukaryotic organelles Prokaryotic cell Eukaryotic cell Eurakyotic organelles (mitochondria & chloroplasts) DNA circular linear circular Histones histone-like yes no proteins Ribosomes 70S 80S 70S ssu rRNA 16S 18S 16S Growth binary fission mitosis binary fission

MOLECULAIR KLONEREN Uit een komplex genoom een klein deel halen en inbrengen in een eenvoudige vector die zich zeer vlug kan vermenigvuldigen DNA mRNA vector cDNA transformatie vector transformatie Genoom bib cDNA bib

Restrictie en aantal fragmenten 4 x 10 6 BP (E. coli), kans op voorkomen van een restrictie site Is 1/ 4n, waarin n het aantal basen is in de site aantal fragmenten fragment grootte (Nf=S/4n) Tetracutter 4.6x106/256=~15 000 ~260 BP Hexacutter ~1000 ~ 4000 BP Octacutter ~ 60 ~66 000 BP

DNA restrictie splicing In vector fragmenten cDNA In vector Transformatie of transductie Genoom bib:109 cellen waarin al dan niet de vector met al dan niet een vreemd restrictiefragment cDNA bib:109 cellen waarin al dan niet de vector met al dan niet een vreemd exon

  ln(1-p)   N = ---------- ln(1-f)  N = aantal clones P = probabiliteit om een bepaalde sequentie op te sporen F = fractie van het genoom aanwezig in iedere clone Menselijk genoom wordt geschat op 3 x 106 KBP   Indien men veronderstelt dat in er in Lambda een insert van 17 KBP ingebouwd is, wordt : 1.7 x 104 f = ------------- 3 x 109 en betekent dit dat 8.1 x 105 fagen nodig zijn om 99% kans te hebben dat om het even welk menselijk gen in op zijn minst één clone zal aanwezig zijn. Indien men pBR322 zou gebruikt hebben (insert van 5 KBP) dan zou de bibliotheek verschillende miljoenen klones moeten bevatten om het gehele genoom te bestrijken.

SCREENEN VAN DE BIBLIOTHEKEN Welke gastheercellen bevatten de vector? 2. Bevat de vector vreemd DNA? 3. Identificatie van het vreemd DNA Via het DNA Via het eiwit

WELKE GASTHEERCELLEN BEVATTEN DE VECTOR? Antibiotica resistentie Lac Z complementatie

2. WELKE VECTOREN BEVATTEN VREEMD DNA? Tweede antibiotica resistentie Lac Z complementatie

IDENTIFICATIE VAN DE CLONES Via het DNA: Probe via reverse translation cDNA, PCR technieken, Subtractieve hybridisatie. Via het eiwit indien het tot expressie komt: Immunologie, Western blot, Gevoelige signalisatie gebruiken