Bijzondere integratie-manipulatiemogelijkheden Homologe recombinatie : recA-afhankelijk (zie Deel 3 : klonering in bacteriën) Lysogene faag integratie-systemen : (vereisen extra proteïnen) E. coli l (Int) Pseudomonas fCTX (Vibrio cholerae) (cytotoxin) Faag P1 : Cre-lox systeem Cre recombinase (Cyclisation recombinase) lox (locus of cross-over(x)) S. cerevisiae : Flp-FRT systeem Flp recombinase of "flippase" van het 2-mu plasmide (Cre en Flp werken zonder accessory proteïnen) Doelwit : loxP en FRT 34-bp box : 13-bp inverted repeats + 8-bp ertussen Circulair DNA : insertie Lineaire DNA's : omwisseling van DNA segmenten

Homologe DNA sequenties op eenzelfde DNA molecule Directe herhaling Omgekeerde herhaling => excisie van tussenliggende sequentie => omkering van tussenliggende sequentie

Resultaat van recombinatie met doelwitten op verschillende DNA-moleculen Insertie van circulair molecule Uitwisseling tussen lineaire moleculen

Integratie van faag l DNA in het E. coli chromosoom de uiterste gedeelten van attP en attB zijn sterk verschillend het binnenste gedeelte (15 bp) waar de recombinatie gebeurt, is nagenoeg identisch de combinatie van P + B' en P' + B vormen attL en attR in de profaag.

Integratie in bvb. Pseudomonas aeruginosa P : phage B : bacterieel L : links R : rechts attP attB attL attR

XerC en XerD : twee chromosoom-gecodeerde recombinasen, die normaal chromosoomdimeren bij de dif recombinatieplaats resolveren. De CTX integratieplaats overlapt met dif. De faag codeert geen eigen integrase. De bacteriële XerCD recombinasen blijken de faaggenomen te kunnen integreren in dif-gelijkende plaatsen in diverse bacteriële species. (nb. resolutie van ColE1 multimeren tot monomeren gebeurt bij de cer locus met het E. coli XecC. )

Chromosomale lokalisatie voor transcriptieanalyse Transfer van E. coli naar P. aeruginosa (een niet-replicatief plasmide (pMB1 afgeleid))  integrase actief – insertie ter hoogte van attB plaats  gekloneerd gen geïnsereerd in neutrale plaats  Flp recombinase doelwitsequenties (FRT, Flp ‘recombinase target sites’) voor in vivo verwijdering van plasmidesequenties – in aanwezigheid van Flp recombinase

Chromosomale lokalisatie voor transcriptieanalyse Nut ? Functieanalyse  expressiestudies door eiwitten te fusioneren aan reportereiwitten zoals b-galactosidase, luciferase - Op plasmide = geen natuurlijke situatie : daarom overdragen naar chromosoom Integratie van niet-replicatief plasmide  selectiedruk vereist (zie eerder) (TcR) Integratie van genfusie op een neutrale plaats Voorbeelden: Integratieve vectoren voor P. aeruginosa pMB1-afgeleide ori tetracycline-resistentiemerker oriT voor conjugatieve overdracht (van E. coli naar P. aeruginosa) att (“attachment sites”) voor P. aeruginosa faag CTX faag CTX integrase (int gen op vector) MCS, geflankeerd door faag T4 transcriptieterminatiesequenties (W) - Flp recombinase doelwitsequenties (FRT, = Flp recombinase target sites) voor in vivo verwijdering van plasmidesequenties – in aanwezigheid van Flp recombinase

Chromosomale lokalisatie voor transcriptieanalyse

De FRT herkenningssequentie voor Flp recombinasen consensus sequenties (a, b, c) : omgekeerde herhaling (a, b) waartussen het recombinatie doelwit ligt (8 bp). (c is niet-essentieel) Analoog voor loxP, de herkenningssequentie van het Cre recombinase (heeft niet het c gedeelte) (FIG 15.7)

Klonering van PCR-product door in vitro recombinatie

Sequentie van loxP plaats ; excisie of inversie naargelang 2 loxP plaatsen in directe of omgekeerde herhaling staan nb. Cre-lox werkt efficientst voor excisie ; integratie vereist bijzondere interventies.

"Recombineering" (bvb. de Gateway vectoren)

NB. gebruik van SceI voor excisie.