Antibiotica op basis van polyketidesynthese. Polyketiden : vroeger ook acylogeninen genoemd. Aanmaak door planten, fungi, bacteriën, (ook door dieren). Similair basismechanisme : maar toch diverse structuren en de verdere afwerking leidt tot een zeer grote diversiteit van productenklasses. Similariteit met vetzuursynthese. Afgeleiden van acetaat, propionaat, butyraat, ...

Vetzuursynthese ketoacylsynthase KS ketoacylreductase KR dehydrase DH enoylreductase ER Sterk lijkend op b-oxidatie, gebeurt elongatie in vier recurrente reacties. In de tekening worden de acetyl en malonyl eenheden getoond als hun acyl carrier protein thioesters : dit is zoals vetzuren in microorganisms en planten worden gesynthetiseerd. Echter, bij dieren gebeuren dezelfde reacties op een groot dimeer proteine, het vetzuursynthase, dat het volledige complement van de enzymatische activiteiten draagt dat nodig is om een vrij vetzuur te synthesizeren en los te laten.

elongatie : condensatiereactie (KS) Drie facetten : acetyl / malonyl transferase (MAT) : transfer van de S-CoA binding naar ACP elongatie : condensatiereactie (KS) + reductie van de b-keto groep door ketoacylreductase (KR), dehydratase (DH) en enoylreductase (ER) (m.a.w. een reductie tot een volledig verzadigde koolstofketen) vrijzetting vanaf ACP door de werking van een thioesterase (TE)

Modellen van vetzuursynthasen

Basis : ==> polyketide : kop-staart (head-to-tail) koppelingen vanaf een starter met malonyl-CoA (of analoge) eenheden. ==> samengestelde ringsystemen starter : R-(C=O)-SCoA extender : (COOH)-CH2-(C=O)-SCoA (decarboxylatie) .naar (C=O) (afsplitsing SCoA) => R-(C=O)-CH2-(C=O)-S-Enz De zeer onstabiele (enzym-gebonden) intermediaire producten ondergaan reducties, dehydrateringen, hydrogenaties, intramoleculaire condensaties tot cyclische en polycyclische structuren. (stabilisatie) Bepalend zijn : - het aantal elongatiestappen - het uiteindelijke cyclisatiepatroon van de lineaire polyketiden (Claisencondensatie, aldolcondensatie, heterocyclische lactonisatie, …) en/of de verdere verwerkingen (modificaties).

Behoorlijke similariteit met de vetzuursynthese, maar geen totale reductie tot alifatische keten. Biosynthetisch moeten we echter rekening houden met de mogelijke competitie/regulatie die dit met de vetzuursynthese kan inhouden. In tegenstelling tot de vetzuursynthese in zoogdiercellen en planten, kunnen diverse acyl-coënzyme A bouwstenen als starters en als ketenverlengers gebruikt worden. Behoorlijke similariteit met NRPS (“non-ribosomal peptide synthetases”) De basismechanismen zijn nu goed begrepen: - ketozuur activatie - koppeling - keto-reductie - dehydratering - enoylreductie - cyclisatie - vrijzetting door thio-esterase

3 klassen polyketidesynthasen (PKS) (“de assemblagelijnen van de natuur”) In streptomyceten komen zowel type I als II voor. type I : modulaire PKS ‘giant multimodular PKS’ - multifunctioneel enzyme; katalyseert de polyketidesynthese op een modulaire wijze (cfr. Figuur) - één of twee polypeptiden met alle katalytische activiteiten. (gelijkenis met type I vetzuursynthase van vertebraten en fungi) type II : multiënzymcomplex, een aggregaat van monofunctionele enzymen : elk domein is gelokaliseerd op een apart enkelvoudig eiwit. (gelijkenis met vetzuursynthase II van bacteriën en planten) type III : homo-dimeer enzyme dat iteratief de synthese uitvoert op een enkele actieve plaats. (eenvoudigste PKS, traditioneel geïsoleerd uit hogere planten ; defensie tegen micro-organismen. Er is toch ook een handvol PKS III geïsoleerd uit bacteriën, bvb. RppA uit Streptomyces griseus, PKS10 en PKS18 uit Mycobacterium tuberculosis, PhlD uit Pseudomonas fluorescens) Voorbeelden : PKS I : macroliden (erythronolide 3 ORF's met elk 2 modules: zie figuur) PKS II : tetracyclines, anthracyclines

Type I PKS-en kunnen verder onderverdeeld worden in : Iteratieve PKS : hergebruikt domeinen in een cyclisch patroon. Modulaire PKS : bevatten de sequentie van afzonderlijke modulen en herhalen geen domeinen. Wat aangemaakt wordt hangt in eerste instantie af van de aanwezige domeinen in de modules. Dit kan gaan van complexe variatie (voorbeeld erythronolide) tot een “zuivere” poly-keton structuur (voorbeeld doxorubicine precursor). De domeinen zijn redelijk goed naspeurbaar op basis van sequentiemotieven in de eiwitten. Dank zij de genoomsequencing van (vaak microbiële) organismen is hierin een explosieve toename van de kennis van deze biosyntheses gekomen.

Elk type I polyketide-synthase module bestaat uit verschillende domeinen met gedefiniëerde functies, gescheiden door korte spacer-gebieden. De volgorde van de modulen en domeinen van een volledig polyketide-synthase is als volgt (van N-terminus tot C-terminus) : Starter of loading module : AT-ACP- Elongatie of extending module : -KS-AT-[DH-ER-KR]-ACP- Terminatie of releasing module : -TE Domeinen: AT : Acyltransferase ACP : Acyl carrier protein met een SH groep op de cofactor, een serine-gekoppeld 4'-fosfopantetheine KS : Ketoacylsynthase met een SH groep op een cysteine zijketen KR : Ketoacylreductase DH : Dehydratase ER : Enoylreductase TE : Thioesterase

Set reacties nodig voor katalyse van één polyketideketen extensieronde : de keten wordt getransfereerd van het vorige ACP domein naar KS het AT selecteert een extender-eenheid en laadt het op volgende ACP Het KS katalyseert de vorming van de C-C binding. Het product blijft gekoppeld op de “swingende” arm van het ACP De keten wordt doorgegeven naar de reducerende activiteiten (KR, DH, ER) voor verwerking. De keten wordt getransfereerd naar het KS in de volgende module.

Organisatie van de erythromycine assemblagelijn.

Erythronolide synthase in Saccharopolyspora erythraea AT : acyltransferase; ACP : acyl carrier proteinen; DH : dehydrase; ER : enoylreductase; KS : b-ketoacid-ACP synthase; KR : b-ketoacid-ACP reductase; TE : thioesterase (cyclase)

Biosynthese van de doxorubicine precursor, (є-rhodomycinone) : the polyketide synthase reactions

Biosynthese van de doxorubicine precursor, (є-rhodomycinone) (een anthracycline)

Enkele voorbeelden van groepen metabolieten : - tetracyclinen 1948 Duggar 4 ringen (1 fenylkern) - anthracyclinen 4 ringen met anthraceenkern - macroliden 1942, 1957 structuur door Woodward: lactonring aantal ringatomen 12 14 16 - ansamycinen 1964, cyclisch amide met naftaleen of benzeen - met naftaleen - C23 - C17 - met benzeen - C17 - C15 - polyenen vb. nystatine, natamycine - polyethers vb. monensine en vele andere.

Tetracyclines : - 4 ringen, één fenylkern - Streptomyces aureofaciens: typische gele kleur - vormt chelaten met mineralen : => is basis voor isolatiemethode - actief tegen Grampositieven en Gramnegatieven: is het meest gebruikte antibioticum na de penicillines. Ook veterinair. 1948 : ontdekking van chloortetracycline (CTC) in een bodemstaal door Duggar. Gevolgd door oxytetracycline in 1950. Tetracycline eerst gemaakt door katalytische dehydrogenatie van CTC in 1953. Nadien (1954) werd het gevonden in S. aureofaciens en rimosus. Ook semi-synthetische derivaten. Biosynthese : initiële polyketidevorming (malonamide-CoA + 8x acetyl-CoA). Dan 3 ringsluitingen. Na methylatie een 4e ring. Nadien verdere modificaties. Tot 72 intermediairen. Sleutelen aan medium: bvb. broomtetracycline i.p.v. CTC indien Br- het enige halide is. Voorbeeld van gedirigeerde biosynthese, door metabolische inhibitie : Streptomyces aureofaciens : synthese chloortetracycline: *) inhibitoren toevoegen die de chloreringsstap inhiberen => synthese van tetracycline *) inhibitie van methylatie (vb. met D-methionine, en andere analogen) => 6-demethylchloortetracycline

starter : malonamide CoA extensie : 8 acetaat-eenheden 3 ringsluitingen, dan verder zoals hiernaast weergegeven : na methylatie wordt de keten van de drager afgesplitst, (en de 4e ring gevormd), waarna verdere modificaties volgen tot chloortetracycline.

Anthracyclinen : - (hydroxy-)anthrachinonkern (i.p.v. één fenylkern in tetracyclines) - vb. daunorubicine, daunomycine, enz. - aangehechte suikers - meer dan 500 structuren gevonden of gesynthetiseerd. - reeds in 1939 geobserveerd als pigmentering door Streptomyces spp. Kleurwijziging in functie van pH (gebruik als pH indicatoren). Meer systematisch bestudeerd (als antibioticum) vanaf de jaren ’50. Sterk antibacterieel maar ook zeer toxisch in de muis => 1964 : blijkt actief te zijn tegen acute leukemie.

Vaak één of meer suikers aan het aglycon aangehecht.

Macroliden : - in 1942 ontdekt; allicht het eerste ontdekte macrolide. Structuur bepaald door Woodward in 1957 (die de naam macrolide voorstelde). - actief tegen (vooral) Grampositieven en een aantal Gramnegatieven. Het zijn tevens de voorkeurantibiotica tegen mycoplasma infecties. - aglycon + suikers suikers : cladinose, mycaminose, mycarose, desosamine, mycinose, oleandrose, enz. (heel wat vanaf dTDP-geactiveerd glucose) (hun voorkomen is uiteraard afhankelijk van de enzymen die in de streptomyceet aanwezig zijn) aglycon : opbouw via een polyketideweg vb. erythromycine: 7 propionaateenheden: vertrekken van methylmalonyl-CoA 3 majeure groepen: aantal ringatomen 12, 14, 16 (inclusief het lacton-zuurstof in de ring) Ook hier weer gedirigeerde biosynthese mogelijk : hybride biosynthese: bvb. nieuwe derivaten van macroliden aanmaak van het aglycon is te blokkeren door cerulenine (inhibitor van vetzuursynthese) macrocyclische lactonring + amino- of/en deoxy-suiker (glycosidische binding) => inhibitie van de aglycon(lactonring)synthese en en exogeen toevoegen van een ander aglycon => ander macrolide antibioticum wordt gevormd.

Hybride biosynthese : De picronolide synthese van de stam wordt geblokkeerd met cerulenine. Aan het medium wordt een aglycon toegevoegd van een andere stam (hier van een tylosine producer). Het speciale suiker wordt aan dit aglycon (protylonolide) aangehecht.

Interspecifieke fusie : tussen een mutant van een macrolide producer : S. hygroscopicus (turimycine) en een mutant van een anthracycline producer : S. violaceus (violamycine) de "recombinant" maakt iremycine : anthracyclinekern met suikersubstituent van het macrolide.

Rifamycine B heeft ook een ether- onderbreking in de ringstructuur.

Poly-enen : nystatine, amphotericine B Ansamycines : - vb. rifamycine : actief tegen Mycobacterium tuberculosis - grote ringstructuur met amidebinding (peptide) - eerste structuur in 1964: rifamycine B Indeling op basis van het aromatische deel en de ringgrootte => naftaleen (C23, C17) versus benzeen (C17, C15) Voorbeelden: naphtomycine, streptovaricine, mycotrienine, herbimycine Poly-enen : nystatine, amphotericine B - lactonstructuur (zoals macroliden) met 4-7 geconjugeerde dubbele bindingen (gewoonlijk all-trans), een mycosamine of andere aminosuiker, en talrijke OH-groepen. - opbouw uit een combinatie van acetyl- en propionylstukken (bvb. 16 acetyl + 3 propionyl) - uit Streptomyces noursei en andere spp. - antifungaal (o.a. tegen gisten gebruikt) - interageren met sterolen in de eukaryotische celmembraan => daarom antifungaal maar niet antibacteriëel - toxisch voor dieren, maar nystatine is het “minst toxische”.

Polyethers : etherbindingen: tetrahydrofuraan en tetrahydropyraan ringen gekoppeld in lineaire structuren - lossen op in lipiden van de membranen : ionoforen (doorlaten van kationen) voorbeeld : monensine (practisch onoplosbaar in water, een weinig in KWS) (zeer oplosbaar in methanol, ethanol, ether, CHCl3, ethylacetaat,...) - uit Streptomyces cinnamonensis - koppeling van acetaat-(5), propionaat-(7) en butyraat(1)-eenheden (variaties hierop bij andere polyethers) - gebruikt als coccidiostaticum, vooral in de pluimveeteelt (Coccidia = protozoaire organismen (vb. Eimeria tenella)) - transporteert monovalente kationen doorheen biologische membranen ionspecificiteit: Ag+ > Na+ > K+ > Rb+ > Cs+ > Li+ > NH4+ (zie figuur) - vormt stabiele complexen met deze ionen => deze worden daardoor oplosbaar in organische solventen. Kan gebruikt worden in specifieke ion-elektroden. - tevens gebruikt als voederadditief: heeft een invloed op de microflora in het rumen van herkauwers (meer propionzuur vormen i.p.v. azijnzuur of boterzuur => energetisch gunstiger) => verhoogt de voederopname bij vee

Monensine

Modulariteit biedt mogelijkheden :

Combinatorial biosynthesis For each type of domain, list of characteristics that would be ideal for combinatorial biosynthesis