Aanvullingen gerichte mutagenese Plaatsgerichte mutagenese Gentechnologie, 2006-2007 - cassette mutagenese - primer-gedirigeerde plaatsgerichte mutagenese - methode van Eckstein - methode van Kunkel - PCR-gebaseerde plaatsgerichte mutagenese - "terugpriming" - inverse PCR

De ‘gapped duplex’ methode voor in vitro mutagenese

- gapped duplex methode, met extra (= begeleidende) mismatch tgo de complementaire streng - transformatie naar een niet-suppressor stam (Su-) - expressie vanaf de parentale streng vereist een amber suppressor - gapped duplex method, met alternating amber mutaties : - Apam => ApR en CmR => Cmam, en vice versa - transformatie naar een Su- stam - maakt consecutieve mutageneses makkelijker - in vivo selectie met een wijziging in de selectiemerker - toevoeging van een selectieprimer die het bla gen wijzigt - mutante bla gen geeft resistentie tegen ceftazidime + ampicilline - niet-mutante transformanten overleven niet op ceftazidime - T4 polymerase vult de openingen (gaps) nauwkeurig in (geen 5'-3' exo, geen ‘strand displacement’) - er is een goede koppeling tussen de mismatchen m.a.w. geen cross-over : aanwezigheid van beide gaat samen - met EcoK en EcoB herkenningssequenties kan omwisseling van 1 bp de (in vivo) restrictiegevoeligheid omkeren A A C n n n n n n G T G C EcoK T G A n n n n n n n n T G C T EcoB T R A C n n n n n n G T G C T samen

Gapped duplex methode met fenotypische selectie Volle balk : wild-type gen Open balk : ambermutant Gapped duplex methode met fenotypische selectie

Ceftazidime Ceftazidime is a third-generation cephalosporin antibiotic. Like other third-generation cephalosporins, it has broad spectrum activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria. Unlike most third-generation agents, it is active against Pseudomonas aeruginosa, however it has weaker activity against Gram-positive microorganisms and is not used for such infections. Ceftazidime is a semisynthetic, broad-spectrum, beta-lactam antibiotic for parenteral administration. Ceftazidime is bactericidal in action exerting its effect by inhibition of enzymes responsible for cell-wall synthesis. A wide range of gram-negative organisms is susceptible to ceftazidime in vitro, including strains resistant to gentamicin and other aminoglycosides. In addition, ceftazidime has been shown to be active against gram-positive organisms. It is highly stable to most clinically important beta-lactamases, plasmid or chromosomal, which are produced by both gram-negative and gram-positive organisms and, consequently, is active against many strains resistant to ampicillin and other cephalosporins. Ceftazidime has activity against the gram-negative organisms Pseudomonas and Enterobacteriaceae. Its activity against Pseudomonas is a distinguishing feature of ceftazidime among the cephalosporins.

5´ p GAT AAA TCT GGA GCC TCC AAG GGT GGG TCT CGC GG 3´ S K G mutante TEM bla 5´ p GAT AAA TCT GGA GCC TCC AAG GGT GGG TCT CGC GG 3´ -----gat aaa tct gga gcc GGT GAG Cgt ggg tct cgc gg------ G E R wild-type TEM bla

De "begeleidende" mutatie creëert een extra resistentie, met name tegen ceftazidime (een cefalosporine).

C T C T T C (1 / 4) C T C T T C n n n n n G A G A A G n n n n n EarI : afsplitsing van extra "staarten" C T C T T C (1 / 4) C T C T T C n n n n n G A G A A G n n n n n

'Excite' -methode Plasmide DNA uit een dam+ stam Inverse PCR met 5'-gefosforyleerde primers (T4-kinase + ATP) Behandeling met DpnI vernietigt de parentale strengen (GmeATC) (inclusief hybride) Circularisatie met ligase en transformatie van E. coli

'GeneTailor' -methode In vitro methylatie van het plasmide DNA (meC) Amplificatie via inverse PCR met overlappende 5'-uiteinden (+ één mismatch primer) Transformatie van E. coli wt-stam (mcrBC+) McrBC endonuclease vernietigt de gemethyleerde matrijsstreng De 'repair'-enzymen circulariseren het linaire product.

Doel : vervangen Trp door Phe Hulp bij screening : MnlI splitsing Mismatch primer : …GCCCTGGGCTTCGGTGGCA… Creëren of verwijderen van een restrictieknipplaats als hulp bij screening naar plaatsspecifieke mutanten

Codewoord tabel voor ‘reverse translation’ Leu = 1T2 Arg = 3G4 Ser = 567

Regio-gerichte mutagenese : Error-prone PCR : verhogen van de foutieve inbouw door Taq polymerase Wijziging van reactiecondities, vooral Mg2+/Mn2+ concentraties en ongelijke concentraties tussen de 4 dNTP's. Mutatiefrequenties (misincorporaties) mogelijke tot 1/300 bp en meer. Suppressie van ambermutaties : SupF (tyrT mutant) bouwt tyrosine in, ongeacht of het oorspronkelijke aminozuur op de amber-mutante positie stond. SupE (glnV mutant) bouwt glutamine in, SupD een serine, SupU tryptofaan, SupP leucine, enz. Men heeft gesleuteld aan de corresponderende genen om dit spectrum te verruimen (tot de meeste van de 20 aminozuren). Inbouw van "onnatuurlijke" aminozuren : amber en opaal codons zijn mogelijke doelwitten. Wijziging van een archaea tRNA zodat UAG of UGA als codon herkend worden. Het bijhorende aminoacyl-tRNA synthetase wordt gemuteerd ("ge-engineered") opdat het een speciaal aminozuur (exclusief !!!) zou opladen : bvb. fenylalanine- of tyrosinederivaten.

m-acetylphenylalanine was substituted for Lys7 in protein Z. m-acetylphenylalanine was substituted for Arg200 in LamB.