Medische Microbiologie Studietaak 1: De prokaryote cel: H4 (Bacteria; archaebacteria niet)

Wat is medische microbiologie? KLASSIEK: Patiënt  arts  lichamelijk onderzoek  klinische diagnose Monster-afname Juiste monster (bloed, urine, pus, faeces, liquor) Juiste afname, labeling, transport/opslag Microscopisch onderzoek gekleurd/ongekleurd (bijv. Gram-preparaat) Kweek en reinkweek op voedingsbodems in voedingsmedia identificatie m.b.v. biochemische en/of serologische testen Gevoeligheid voor antibiotica Diffusiemethoden, breekpunten/MIC MOLECULAIR: Serologische diagnostiek: meting specifieke antistoffen DNA-technologie

Peptidoglycaan- celwand Binaire deling Prokaryoten Klein, < 2 µm 1 circulair chromosoom Geen kernmembraan Geen histonen Geen organellen Ribosomen 70S Peptidoglycaan- celwand Binaire deling Eukaryoten Groter, 2-20 µm Gepaarde chromosomen Kernmembraan Histonen Organellen Ribosomen 80S (muv mito: 70S) Evt. polysacharide celwand Mitose

Gemiddelde grootte: 0,2 –1,0 µm  2 - 8 µm Basisvormen: zie boek!

Rechthoekige Haloarcula Bijzondere vormen Stervormige Stella Rechthoekige Haloarcula Meeste bacteriesoorten zijn monomorf (één vorm) Sommigen zijn pleomorf (meerdere vormen) Geen leerstof Figure 4.5

Rangschikkingen Paren: diplococci, diplobacilli Clusters: staphylococci Ketens: streptococci, streptobacilli

Bouw van bacteriën Celmembraan Celwand Flagellen/fimbriae/pili Kernmateriaal Endporen Een of twee membranen Slijmlaag/kapsel Figure 4.6a, b

Celwand Voorkomt osmotische lysis Is bij bacteriën gemaakt van peptidoglycaan Figure 4.6a, b

Peptidoglycaan Polymeer van een disacharide dat is opgebouwd uit N-acetylglucosamine (NAG) en N-acetylmuraminezuur (NAM) Verbonden door polypeptiden Figure 4.13a

G+ celwand G- celwand Dikke peptidoglycaanlaag Teichoïnezuren Mycolinezuur*) Geen LPS Dunne peptidoglycaanlaag Geen teichoïnezuren Buitenmembraan LPS (endotoxine) *): Bij zuurvaste cellen

Gram-positieve celwanden Teichoïnezuren: Lipoteichoïnezuur verbindt met plasmamembraan Wand-teichoïnezuur verbindt met peptidoglycaan Teichoïnezuren reguleren mogelijk de beweging van kationen Polysachariden zorgen voor antigene variatie Figure 4.13b

Gram-negatieve buitenmembraan Lipopolysachariden (LPS), lipoproteïnen, fosfolipiden Omsluit het periplasma Beschermt tegen fagocyten, complement, antibiotica LPS: Polysacharide-deel: antigeen; bv. onderscheiding van E. coli O157:H7 Lipo-deel: lipide A, is een endotoxine Porines (eiwitten) vormen kanalen door de membraan

Differentiatiekleuringen Onderscheid in bacteriën maken op basis van kleuring (microscoop) Gram-kleuring en Ziehl-Neelsen-kleuring (zuurvaste kleuring) Deze komen uit HOOFDSTUK 3!! (laatste paar pagina’s)

Mechanisme Gramkleuring Er vormen zich kristalviolet-jodium (KV-I) kristallen in het cytoplasma Gram-positieve cel: Alcohol dehydrateert het peptidoglycaan KV-I kristallen blijven in de cel Gram-negatieve cel: Alcohol lost buitenmembraan op en maakt gaten in peptidoglycaan KV-I wordt weggespoeld

Gram Stain Color of Gram + cells Gram – cells Primary stain: Crystal violet Purple Mordant: Iodine Decolorizing agent: Alcohol-acetone Colorless Counterstain: Safranin Red

Zuurvaste kleuring (Ziehl-Neelsen) Cellen met mycolinezuur in hun celwand houden kleuring vast bij behandeling met zure alcohol: zuurvaste cellen Mycobacterium tuberculosis, M. leprae, Nocardia, sommige Corynebacteriën Niet-zuurvaste cellen verliezen de kleuring als ze gespoeld worden met zure alcohol en worden meestal tegengekleurd Geassocieerde flora, ont- stekingscellen Figure 3.11

Speciale kleuringen Negatieve kleuring bruikbaar voor kapsels Verhitting nodig om endosporen te kunnen kleuren Voor het kleuren van flagellen is een fixatief (mordant) nodig dat ze dik genoeg maakt om ze te kunnen zien Figure 3.12a-c

Medische Microbiologie Studietaak 1: De groei en het kweken van micro-organismen H6

Microbiële groei Groei: toename aantal cellen (niet celgrootte!) Benodigdheden/belangrijk: Minimum, optimum, maximum kweektemperatuur pH tussen 6,5 en 7,5 (m.u.v. alkalofiel, acidofiel) Water (in lab: demiwater / milliQ) Osmotische druk (m.n. bij halofiel, facultatief halofiel) Koolstof, stikstof, zwavel, fosfor, spoorelementen, groeifactoren

THE REQUIREMENTS FOR GROWTH PHYSICAL REQUIREMENTS

TEMPERATURE

Psychrotrofen: Mesofielen: Groeien tussen 0°C en 20-30°C Veroorzaken voedselbederf Mesofielen: Optimum groeitemperatuur 25-40°C Meest voorkomende type, waaronder de meeste pathogene - en voedselbedervende m.o. Micro-organismen die zich hebben aangepast aan het leven in een dierlijke gastheer: optimum temperatuur dichtbij die van gastheer Veel pathogene bacteriën: optimum temperatuur 37°C

Hyperthermofielen: Optimum temperatuur boven de 80°C Archaea Geen leerstof Hyperthermofielen: Optimum temperatuur boven de 80°C Archaea Hete bronnen rond vulkanische activiteit Meestal zwavel nodig voor metabolisme Interessant voor de biotechnologie, als bron van hittebestendige enzymen Pyrococcus furiosus

pH

De meeste bacteriën groeien bij neutrale pH (6,5-7,5) Fungi groeien bij zure pH (5-6) Acidofiele bacteriën groeien in zure milieus Kweken van bacteriën in het lab: uitscheiding van zuren (anaeroob katabolisme!) die de groei uiteindelijk gaan remmen  medium bufferen; mogelijke buffers: In veel media zit pepton of aminozuren (als N-bron en als az-bron); deze bufferen In veel media zitten fosfaat-zouten (als P-bron); deze bufferen, met name in het neutrale pH-gebied

OSMOTIC PRESSURE

Hypertone omgeving: plasmolyse Conservering voeding via extra suiker of zout Max. % agar in vaste media (anders te grote osmotische druk) Hypotone omgeving (bv. demiwater): water de cel in, maar celwand behoedt cel meestal tegen lysis Figure 6.4

Geen leerstof Extremofielen Bij de extremofielen die we tot nu toe gezien hebben (temperatuur, zout, zuur) gaat het vaak om Archaebacteriën (Archaea)

THE REQUIREMENTS FOR GROWTH CHEMICAL REQUIREMENTS

CARBON (Koolstof) Als basis voor alle biomoleculen en als energiebron (covalente bindingen tussen C-atomen) Chemoheterotrofen gebruiken organische stoffen (biomoleculen) als C- en energiebron Autotrofen gebruiken CO2 als C-bron

NITROGEN, SULFUR, PHOSPHORUS, TRACE ELEMENTS Stikstof: Nodig voor alle aminozuren, eiwitten N-bron: Meeste bacteriën breken eiwitten af Sommige bacteriën gebruiken NH4+ of NO3 Enkele bacteriën gebruiken N2 (stikstoffixatie) Zwavel: nodig voor bepaalde aminozuren, thiamine, biotine S-bron: Sommige bacteriën gebruiken SO42 of H2S Fosfor: Nodig voor DNA, RNA, ATP en membranen P-bron: fosfaat Spore-elementen: kleine hoeveelheden anorganische elementen, meestal enzym-cofactoren

OXYGEN

Zuurstof is essentieel voor het leven op aarde, maar het is in feite een giftig gas Op de oer-aarde was er zeer weinig zuurstof en waarschijnlijk was er zelfs geen leven ontstaan als er (veel) zuurstof aanwezig was geweest Levensvormen met aerobe respiratie hebben zuurstof nodig voor hun katabolisme, waarbij zuurstof wordt omgezet in ……: Reultaat: veel ATP en neutralisatie van een potentieel giftig gas (win-win situatie! )

Naamgeving zuurstofbehoefte Obligaat aeroben: Hebben zuurstof nodig om te leven (aerobe respiratie) Zonder zuurstof gaan ze dood Facultatief anaeroben: Gebruiken zuurstof, maar kunnen ook zonder (switchen tussen aerobe respiratie (veel ATP) en fermentatie (weinig ATP)) Obligaat anaeroben: Gebruiken geen zuurstof en kunnen er meestal ook niet tegen Meesten: alleen fermentatie (incl. glycolyse) ; bep. soorten in staat tot anaerobe respiratie = respiratie met alternatieve elektronenacceptor

Obligaat (strikt) aeroob: Vrijwel alle dieren (op organisme-niveau!), de meeste schimmels, verschillende bacteriën (bv. Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis) Strikt aerobe micro-organismen kennen geen fermentatie Dieren zijn strikt aeroob omdat ze het op organisme-niveau niet lang uithouden zonder zuurstof (te weinig ATP) Veel ‘oxidatieve stress’ = giftige effect zuurstof, dus goed verdedigingsmechamisme tegen zuurstof nodig (zie later)

Facultatief anaeroben: Hebben verdedigingsmechanisme tegen toxisch effect zuurstof Groeien uiteraard beter met zuurstof dan zonder Veel bacteriën (bv. Escherichia coli, Bacillus anthracis, Salmonella, bep. Lactobacilli) en veel gisten en bv. ook dierlijke cellen Obligaat (strikt) anaeroben: Zijn geen zuurstof gewend Hebben daarom geen verdedigingsmechanisme tegen het toxische effect van zuurstof Voorbeelden obligaat anaeroben met fermentatie: bep. Lactobacilli en andere darmflora-bacteriën, Clostridium botulinum, Clostridium tetani Voorbeelden obligaat anaeroben met alternatieve elektronenacceptor (= anaerobe respiratie): methaanproduceerders (‘methanogenen’) in moerassen, spijsverteringsstelsel van herkauwers, anaerobe rioolwaterzuivering

Giftige vormen van zuurstof Superoxide vrije radicalen: O2 In kleine hoeveelheden gevormd tijdens aerobe respiratie, maar ook bij obligaat anaeroben Zeer toxisch Alle organismen die groeien in aanwezigheid O2 maken deze vorm van zuurstof onschadelijk via: Deze formule klopt niet, maar hij zit op deze manier in de ppt (gemaakt door de auteur) en ik kan deze niet aanpassen: zie boek voor correcte formule

Bevindt zich in de H2O2 uit de SOD-reactie Peroxide anion: O22 Bevindt zich in de H2O2 uit de SOD-reactie Giftig, dus: verder verwerkt via een van deze reacties (meestal katalase) : De onderste formule klopt niet, maar hij zit op deze manier in de ppt (gemaakt door de auteur) en ik kan deze niet aanpassen: zie boek voor correcte formule

Obligaat aeroben en facultatief anaeroben: SOD en katalase/peroxidase ontgiften Obligaat anaeroben: Geen ontgiftende enzymen Aerotolerante anaeroben: Wel SOD, geen katalase/peroxidase Gedeeltelijke ontgifting Microaerofielen: Waarschijnlijk geen ontgiftende enzymen, maar wel zuurstof nodig Zuurstof niet giftig bij lage concentraties

Kies uit: Aerotolerante anaeroben, facultatief anaeroben, microaerofielen, obligaat aeroben, obligaat anaeroben

ORGANIC GROWTH FACTORS Essentiële verbindingen Biomoleculen die het organisme zelf niet kan maken Om welke biomoleculen het precies gaat, is afhankelijk van de betreffende bacteriesoort: veel bacteriën kunnen alle of de meeste biomoleculen zelf maken Vitamines, aminozuren, purines, pyrimidines

THE REQUIREMENTS FOR GROWTH CULTURE MEDIA

Definities Definities: (Kweek)medium: Mengsel van voedingsstoffen voor groei van micro-organisme(n) Steriel: Geen levende m.o. aanwezig Inoculum: Aan (kweek)medium toegevoegde m.o. Enten: het toevoegen van het inoculum Kweek of culture: M.o. in of op een (kweek)medium Meestal van te voren samengesteld door commerciële leveranciers: ‘just add water’ en steriliseren

Agar Complex polysacharide uit zeewier Gebruikt voor de bereiding van vaste media: voedingsbodems, schuine agars e.d. De meeste m.o. kunnen agar niet verteren Wordt vloeibaar bij 100°C Wordt weer hard bij ~40°C

Soorten media Chemisch gedefinieerde media: Complexe media Exacte chemische samenstelling is bekend Lastig te maken en langzame groei: alleen speciale toep. Complexe media

Complexe media Extracten, bv. van gist of vlees (vandaar dat nog vaak de term ‘bouillon’ wordt gebruikt; dateert uit de tijd van Pasteur) en Peptonen Korte, wateroplosbare peptiden, onstaan uit zure hydrolyse of enzymatische digestie van een eiwitbron (bv. soja, melk, ….) Meest gebruikt voor het kweken in het lab Voornaamste ingrediënt zijn eiwitten: energiebron, C-bron, N-bron, S-bron Vitaminen en andere organische groeifactoren meestal via vlees- of gist-extract (= daarnaast ook extra C- en N-bron) Bij anaeroob kweken MOET ook een suiker (meestal glucose) worden toegevoegd voor de energie!

Gedefinieerd vs. complex medium Table 6.2 & 6.4

Anaeroob kweken Vloeibaar: Voedingsbodems: Reducerende media Bevatten stoffen (thioglycolaat of oxyrase) die een verbinding aangaan met O2 Vlak van te voren verhitten om gebonden O2 te verdrijven Voedingsbodems: Anaerobe vaten: zie volgende dia Oxyrase/OxyPlate Enzym oxyrase zet O2 om in H2O Enzym in voedingsbodem: hele plaat wordt een anaerobe ‘kamer’: de OxyPlate Geen speciale apparatuur nodig

Anaeroob vat Zakje met natriumbicarbonaat en natriumborohydride bevochtigen Er onstaat H2 en CO2 Palladium combineert H2 met O2 ( H2O) Figure 6.5

Speciale kweekmethoden Bij m.o.’s die niet op of in media groeien: speciale kweektechnieken nodig, zoals Proefdieren Celkweek Veel m.o.’s groeien slechts bij 5-15% CO2 Figure 6.6

Selectieve en differentiële media Selectieve media: Gewenste bacteriën groeien wel, ongewenste niet; bv: Bismuthsulfietagar bij S. typhi Briljantgroenagar bij Salmonella spp. Eosinemethyleenblauwagar (EMB) bij E. coli Differentiële media: Om kolonies van het aan te tonen m.o. te kunnen onderscheiden van kolonies van andere m.o.; bv: Bloedagar: hemolyse door S. pyogenes EMB medium Enterobacter aerogenes en Escherichia coli De voorbeelden zijn nu nog geen leerstof (komt vanzelf later in module) Figure 6.9b, c

Differentiële media Om onderscheid te kunnen maken tussen verschillende bacteriën in een mengsel, om zodoende specifieke bacteriën aan te kunnen tonen en te onderscheiden van andere Staphylococcus aureus op telluriet-glycine medium Figure 6.9a

Verrijkingskweken In feite selectief medium, maar dan zodanig dat de groei van een bepaald m.o. zodanig wordt bevorderd dat detecteerbare hoeveelheden cellen ontstaan Voorbeeld (toepassing): verrijking van fenol-afbrekende m.o. in de bodem door te weken met fenol als enige C- en energiebron

Reinkweken Een reinkweek bevat maar één soort of stam Een kolonie is een populatie van cellen op een voedingsbodem die afkomstig is van één cel of spore of van een groep van aan elkaar vastzittende cellen Een kolonie wordt vaak een kolonievormende eenheid (KVE) of colony-forming unit (CFU) genoemd

Methode om losliggende kolonies krijgen Figure 6.10a, b

Het bewaren van bacteriekweken Meest gebruikte manieren: Diepvries: -50°tot -95°C (meestal in aanwezigheid van glycero als antivries!) Lyofilisering (vriesdrogen): Bevroren (-54° tot -72°C) en gedehydrateerd in een vacuüm

THE GROWTH OF BACTERIAL CULTURES

Vermeerdering/groei van bacteriën Bij bacteriën bijna altijd binaire deling Synthese celmateriaal Instulping celmembraan Splitsing in twee cellen Groei: aantal bacteriën/bacteriemassa Per volume-eenheid: #cellen/ml, droge stof/ml Verdubbelingstijd: delingssnelheid (bijv. per uur), toename massa Generatietijd of verdubbelingstijd

Generatietijd Website Tortora: Intetractive Tutorials H6: alle drie! http://www.cellsalive.com/ecoli.htm Berekening aantal cellen Per generatie verdubbeling van het aantal cellen Dus: Aantal cellen = N0 x 2aantal generaties Website Tortora: Intetractive Tutorials H6: alle drie! Figure 6.12b

Generatietijd Zie appendix D G (generatietijd) = t(tijd, in minuten)/n(aantal generaties) G = generatietijd = tijd die 1 celdeling duurt = t/n t = een bepaald tijdsinterval: aan het begin en aan het eind hiervan wordt het aantal cellen bepaald Ao = aantal cellen bij het begin van het tijdsinterval At = aantal cellen aan het eind van het tijdsinterval Celdeling: At = Ao x 2n Oplossen voor n: logAt = logAo + log 2n = logAo + nlog2 nlog2 = logAt – logAo n = logAt - logAo            log2 n = logAt - logAo            0,301

Berekening aantal generaties en generatietijd Stel: 100 cellen groeien in 5 uur naar een totaal van 1.720.320 cellen: Aantal generaties n = log(1.720.320) – log(100) = 14,3 log2 Generatietijd G: 5 x 60 min. / n = 21 minuten/generatie

Groeicurve exponentiële groei Figure 6.13

Groeifasen http://wps.aw.com/bc_tfc_microplace_8/0,7590,665416-,00.html Figure 6.14

Meting van bacteriegroei Directe methoden Plate Count methode seriële verdunningen van een sample, uitplaten, incuberen en tellen (platen met 25-250 KVE’s) Filtratiemethode (bij lage hoeveelheden bacteriën) hoeveelheid filtreren door membraanfilter, filter op plaat incuberen Directe telling bacteriemonster in telkamer beoordelen Meting optische dichtheid turbiditeit (vlg extinctie) evenredig met bacterieconcentratie Indirect methoden Metabole activiteit Drooggewicht Figure 6.15, top portion

Directe meting: Plate Counts Kolonies tellen: Monster eerst ‘doorverdunnen’ Figure 6.15, top portion

Plate Counts Een aantal verdunningen uitplaten Waarom? Figure 6.16

Na incubatie: tel aantal kolonies op platen met 25-250 kolonies (CFU/KVE) Plate Counts Figure 6.15

Filtration Bij zeer kleine aantallen, m.n. in watermonsters Figure 6.17a, b

Direct Microscopic count Figure 6.19

Direct Microscopic Count

Direct Microscopic Count Nadelen: Beweeglijke bacteriën moeilijk te tellen Dode cellen niet of nauwelijks te onderscheiden van levende Vrij hoge celdichtheden nodig om betrouwbaar te kunnen tellen Voordeel: Snel (geen incubatietijd)

Indirecte Methoden Troebeling/turbiditeit (= ‘Turbidity’) Figure 620

Turbiditeit Spectrofotometer Absorptie (A) / extinctie (E) / optische dichtheid (OD) A / E / OD = -logT; T= transmissie Hoe hoger de OD, hoe meer cellen aanwezig In logaritmische groeifase loopt OD tegen tijd in ongeveer een rechte lijn Wanneer bekend is hoeveel cellen/ml met een bepaalde OD overeenkomen (1 keer uitzoeken en standaardcurve maken), kan men vanuit een gemeten OD het aantal cellen uitrekenen Gevoeligheid: werkt vanaf 107 cellen/ml; bij lagere aantallen geen troebeling; bij te hoge OD: verdunnen

Voorbeeld standaardcurve Bij Escherichia coli loopt deze curve over een groot gebied lineair als je de OD meet bij 600 nm; vuistregel: 1 OD-eenheid bij 600 nm komt overeen met 8 x 108 cellen

THE END