CD4 + CD25 + T R Cells Suppress Innate Immune Pathology Through Cytokine- dependent Mechanisms

Introduction • Intestinale inflammatie wordt veroorzaakt door disregulatie van de mucosale T cellen op bepaalde antigenen. • De subpopulatie CD4+CD45RB high heeft de eigenschap om in Immunodeficiënte muizen IBD te induceren • De regulatoire T cellen (CD4+CD45RB low CD25+) hebben dan weer een inhiberende / regulerende functie.  Th1 gemedieerde respons

Wijze van inhiberende werking : - Inhibitie van andere T cellen door cel-cel contact - Downregulatie van APC - Immunosuppressieve cytokines : IL-10 en TGF-β, werken zowel op T cellen als op cellen van het aangeboren immuunsysteem Maar rol van Treg bij Niet-T-cel-gemedieerde immuunpathologie nog niet onderzocht / bewezen.

• Microflora is van essentieel belang voor de ontwikkeling van IBD • Induceerbaar door bepaalde pathogene bacteriën • In immunodeficiënte muizen zoals IL-10-/- of in RAG-/- muizen geconstitueerd met CD45RB high cellen. Vb Helicobacter Hepaticus : -gram-negatief en spiraalvormig -koloniseert intestinale crypten van caecum en colon -levenslange infectie

Resultaten 1)Treg cellen verhinderen intestinale inflammatie, zowel de T-cel afhankelijke als onafhankelijke weg, bij infectie met H.Hepaticus Test: Isoleren van CD45RB low CD25+ en CD45RB low CD25- en coïnjecteren met CD4+CD45RB high in RAG2-/- muizen  vervolgens infecteren met H.Hepaticus

• Reconstitutie met enkel CD4+CD45RBhigh T cellen veroorzaakte slechts zeer milde collitis (vergelijk D en E)  Infectie met H.Hepaticus veroorzaakte wel ernstige intestinale inflammatie (E)  cel hyperplasie  infiltratie  goblet cel depletie

• cotransfer van de CD4+CD45RB low CD25+ (Treg) zorgde voor een inhibitie van de H.Hepaticus geïnduceerde ontsteking (F) • cotransfer van CD4+CD45RB low CD25- had geen inhiberend effect (G)  zoals aangetoond in voorgaande studies

• indien geen transfer en enkel infectie met H.Hepaticus  toch ontwikkeling van ontsteking • deze T-cel onafhankelijke pathologie heeft zelfde karakteristieken, maar iets milder (B).  cel hyperplasie  weinig depletie  minder infiltratie van mononucleairen en polynucleair • ook inhibitie door Treg (CD25+) en niet door CD25-

2) T-cel onafhankelijke pathologie door infectie met H.Hepaticus is gedreven door proinflammatoire cytokines en wordt geassocieerd met lokale en systemische activatie van het aangeboren immuunsysteem, dat kan geïnhibeerd worden door de Treg cellen • Test : Infectie van RAG-/- muizen met H.Hepaticus en toedienen van Ab tegen IL-12p40 of TNF-α (belangrijke mediatoren van aangeboren immuniteit)  Inhibitie van pathologie  voorkomen van splenomegaly

Splenomegaly • mbv FACS kijken welke celpopulaties hiervoor verantwoordelijk zijn • A = Totaal # milt cellen • B = Neutrofielen • C = Monocyten/Macrofagen • D = Dendritische cellen • E = NK cellen • F = IFN-y prod NK cellen

Samenvatting : • grootste toename bij neutrofielen en monocyten/macrofagen • lichte toename van dendritische cellen (2 x) • lichte toename van NK cellen (2 x), maar ook proportionele toename van IFN-y producerende NK cellen (2 x) en dus een 4 maal grotere IFN-y productie  duidt op sterkte activatie van het aangeboren immuunsysteem • Transfer van Treg zorgde voor een zichtbare reductie

• Test : Beoordelen van het aangeboren immuunsysteem op plaats van infectie  isoleren van leukocyten thv lamina propria (LPL) en thv senterische lymfe knopen (MLN)  samenstelling mbv flow cytometry bepalen  weinig leukocyten, dus gepoolde LPL en MLN populaties gebruiken van verschillende muizen

Samenvatting LPL :

MLN : Treg beïnvloeden dus zowel andere T cellen als cellen van het aangeboren immuunsysteem Werken zowel systemisch als lokaal,inhibitie van accumulatie en activatie

3) Treg cellen hebben geen invloed op kolonisatie van H.Hepaticus • Test : RT-PCR voor detectie van H.Hepaticus levels in colon en caecum • 5 tot 10 maal grotere concentraties in caecum tov colon • Geen verschil bij muizen zonder en met reconstitutie met Treg (CD25+)  protectief effect van Treg is dus niet te wijten aan vermindering van kolonisatie van H.Hepaticus

4) Protectie door Treg cellen tegen T-cel onafhankelijke pathologie is cytokine afhankelijk • Belang van IL-10 en TGF-β reeds aangetoond in vorige studies • ontstaan van intestinale inflammatie in IL-10-/- muizen Test : geïnfecteerde muizen reconstitueren met Treg en vervolgens toedienen van monoklonale Ab tegen IL-10R of TGF-β  volledig verlies van inhibitie en bevestiging belang van IL-10

Discussie • Het aangeboren immuunsysteem verantwoordelijk bij pathogenese afkomstig van pathogeen organisme (H.Hepaticus) • T-cel onafhankelijke inflammatie: • gedreven door pro-inflammatoire cytokines • zowel lokaal als systemisch • CD4+CD25+ Treg cellen immuun suppressieve werking op T-cel afhankelijk en T-clonafhankelijke inflammatie

Mechanisme van inhibitie door Treg cellen • verschillende in vivo modellen tonen verschillende patronen van immuun suppressieve cytokinen • Cel-contact afhankelijke mechanismen • Regulator activiteit door ale T-cellen die strijden voor plaats en overlevingsfactoren tegen pathogene T-cellen  In onze studie enkel de CD25+ subpopulatie inhibitie van T-cel onafhankelijke infammatie

• IL-10: • heeft een cruciale rol, zowel in T-cel afhankelijke als onafhankelijke inflammatie (voorgaande studies) • Inhibitie van pro-inflammatoire cytokinen • Inhibitie van chemokine producerende monocyten/ macrofagen en neutrophielen Suppressie van T-cel onafhankelijke pathology was afhankelijk van IL-10 en TGF-β.

• Epitheliale cel hyperplasie • Infiltratie van granulocyten en mononucleairen • Kolonisatie voornamelijk in het caecum • Pro-inflammatoire cytokines noodzakelijk (IL-12p40 en TNF-α) en ook andere verhoogde concentraties van cytokines Karakteristieken van H.Hepaticus geïnduceerde inflammatie

Voor het ontstaan van intestinale colitis was infectie met H.Hepaticus noodzakelijk, reconstitutie met CD4+CD45RB high T-cellen was niet voldoende Reden: Tegenstelling met voorgaande studies • Genetische verschillen • Intestinale flora • Omgevingsfactoren

Inflammatie door H.Hepaticus: • lokaal (mucosa) • systemisch (splenomegaly) Reconstitutie met Treg cellen inhibeert de patogenese op beide plaatsen, lokaal bij infectie als systemisch ter preventie. CD4+CD25+ Treg cellen hebben de mogelijkheid om de pathogenese te onderdrukken zonder voorgaand contact met de peptiden van de pathogene bacterie.