cDNA klonering : overzicht van werktuigen / strategieën / procedures

Presentatie over: "cDNA klonering : overzicht van werktuigen / strategieën / procedures"— Transcript van de presentatie:

1 cDNA klonering : overzicht van werktuigen / strategieën / procedures
Activiteit aminozuursequentie CEL Antisera reverse translatie proteine extract Sonde Tumorlijn Inductie Natuurlijke condition mRNA in vitro translatie Chemische DNA synthesis TEST oligo-dT chromatografie polyA+ mRNA cDNA klonering kloons Hybridisatie DNA sequencing Expressie / productie EST banken HART HST cDNA klonering : overzicht van werktuigen / strategieën / procedures

2 (eiwit gecodeerd door het gen) - vergelijking van toestanden
Screening - isoleren van een gen, op basis van gekende activiteit (eiwit gecodeerd door het gen) - vergelijking van toestanden (welke en hoeveel mRNA's zijn erbij betrokken?)

3 Screening van DNA banken
overzicht van cDNA kloneerstrategieën/werktuigen/procedures/samenspel uitplaten van een kloonbank : als cfu/ml of pfu/ml (suspensie) lage densiteit (individuele kloons) of hoge densiteit (tot een confluente laag) (9 cm platen, 13 cm platen, 21 x 21 cm vierkante platen, microtiterplaten ( ) - directe selectie : slechts zeer exceptioneel - bvb. klonering van een antibioticum resistantiegen - bvb. auxotrofe merkers : ‘marker rescue’ benadering : een mutante stam of speciaal medium/conditie is vereist (vb. isolering van het trpA gen) - bvb. ‘complementation cloning’ : met genomische DNA fragmenten van gist kan het defect in een E. coli leuB mutant gecomplementeerd worden => isolering van het gist LEU2 gen - daarnaast is ook directe identificatie mogelijk : elk gen nodig voor een biochemische conversie van een verbinding in het groeimedium tot een visualiseerbaar product (kleur, fluorescentie, …) (vb. LacZ)

4

5 Rechtstreekse selectie van een
kloon die het R6-5 kanamycine- resistentiegen (kanR) bevat.

6 Directe selectie van een trpA gen met behulp van een trpA-
stam van E. coli Een geschikte mutante stam moet beschikbaar zijn. available.

7 Functionele complementatie
met DNA uit BAC kloons in transgene muizen.

8 => gen-gericht versus vergelijking-gericht gen-gericht
- detectie van de gezochte kloon is gebaseerd op ‘informatie’ : dit kan proteïne of nucleïnezuur (sequentie) zijn - hybridisatie : sonde (probe) vereist kolonie hybridisatie, kolonie ‘lifting’ plaque hybridisatie probes: (in volgorde van dalende hoeveelheid informatie) - sequentie is bekend - homologe sequentie beschikbaar : (een fragment volstaat) - heterologe sequentie beschikbaar : welke temperatuur? => ZOO blots - aminozuursequentie van een proteïne (geheel of deels) gekend - synthetische/gedegenereerde sondes (oligonucleotiden) set van individuele oligonucleotiden of mengsel of ‘guessmer’ gebruik van deoxy-inosine, enz. - screening met PCR : DNA uit kloon pools, bij positief signaal dilueren tot uiteindelijk een homogene kloon bekomen wordt (de sequenties waar de primers moeten aanhechten moeten uiteraard gekend zijn ; maar ook hier kunnen mixed primers of degenereerde primers gebruikt worden)

9 Screening door hybridisatie
DNA sondes RNA sondes oligonucleotide sondes "mixed probes" en guessmers "mismatch probes" homologe sondes heterologe sondes => "ZOO blots" polyclonale antisera monoclonale antilichamen

10

11 Gelijkaardige procedures voor plaque hybridisatie.
Kolonie hybridisatie. De sonde ("probe") is radioactief gemerkt of enzymatisch, fluorescent of immunologisch geëtiketteerd ("tag"). Detectie door autoradiografie, kleur, fluorescentie, enz. Gelijkaardige procedures voor plaque hybridisatie.

12 Heterologe hybridisatie

13

14 De aminozuursequentie van gist cytochrome c.
Het hexapeptide dat geel ingekleurd is, is een voorbeeld van hoe een nucleotidesequentie kan voorspeld worden vanuit een aminozuursequentie. -trp-asp-glu-asn-asn-met- -TGG-GAY-GAR-AAY-AAY-ATG- 18-meer 2 x 2 x 2 x 2 16 oligonucleotiden vertegenwoordigen alle mogelijkheden.

15 Gebruik van een synthetisch, gemerkt of geëtiketteerd
oligonucleotide (of mengsel van alle mogelijke sequenties) om een kloon van het cytochroom c gen van gist te identificeren. => twee hybridisatierondes : van waarschijnlijk tot definitief.

16 Kodewoordgebruik (hulpmiddel bij uittekenen van een
frequenties per duizend (absoluut aantal) (hulpmiddel bij uittekenen van een guessmer ; uiteraard de tabel nemen van het organisme waarvan de insert-DNAs afkomstig zijn.) in E. coli O157:H7 EDL933 5347 CDS's ( codons) in E. coli K12 14 CDS's (5122 codons) UUU 22.2 (35846) UCU 8.7 (14013) UAU 16.5 (26648) UGU 5.2 ( 8458) UUC 15.9 (25565) UCC 8.9 (14420) UAC 12.3 (19766) UGC 6.4 (10285) UUA 13.8 (22316) UCA 8.1 (13117) UAA 2.0 ( 3163) UGA 1.1 ( 1751) UUG 13.0 (20904) UCG 8.8 (14220) UAG 0.3 ( 435) UGG 15.3 (24656) CUU 11.4 (18366) CCU 7.2 (11657) CAU 12.8 (20631) CGU 20.2 (32590) CUC 10.5 (16869) CCC 5.6 ( 8961) CAC 9.4 (15116) CGC 20.8 (33547) CUA 3.9 ( 6257) CCA 8.4 (13507) CAA 14.7 (23703) CGA 3.8 ( 6166) CUG 51.1 (82300) CCG 22.4 (36178) CAG 29.4 (47324) CGG 6.2 ( 9955) AUU 29.7 (47838) ACU 9.1 (14639) AAU 19.2 (30864) AGU 9.4 (15123) AUC 23.9 (38504) ACC 22.8 (36724) AAC 21.7 (34907) AGC 16.0 (25800) AUA 5.5 ( 8835) ACA 8.1 (13030) AAA 34.0 (54723) AGA 2.9 ( 4656) AUG 27.2 (43846) ACG 15.0 (24122) AAG 11.0 (17729) AGG 1.8 ( 2915) GUU 18.1 (29200) GCU 15.4 (24855) GAU 32.8 (52914) GGU 24.2 (38983) GUC 14.8 (23870) GCC 25.2 (40571) GAC 19.2 (30953) GGC 28.1 (45226) GUA 10.9 (17561) GCA 20.7 (33343) GAA 39.3 (63339) GGA 8.9 (14286) GUG 26.2 (42261) GCG 32.3 (52091) GAG 18.7 (30158) GGG 11.8 (18947) UUU 19.7 (101) UCU 5.7 ( 29) UAU 16.8 ( 86) UGU 5.9 ( 30) UUC 15.0 ( 77) UCC 5.5 ( 28) UAC 14.6 ( 75) UGC 8.0 ( 41) UUA 15.2 ( 78) UCA 7.8 ( 40) UAA 1.8 ( 9) UGA 1.0 ( 5) UUG 11.9 ( 61) UCG 8.0 ( 41) UAG 0.0 ( 0) UGG 10.7 ( 55) CUU 11.9 ( 61) CCU 8.4 ( 43) CAU 15.8 ( 81) CGU 21.1 (108) CUC 10.5 ( 54) CCC 6.4 ( 33) CAC 13.1 ( 67) CGC 26.0 (133) CUA 5.3 ( 27) CCA 6.6 ( 34) CAA 12.1 ( 62) CGA 4.3 ( 22) CUG 46.9 (240) CCG 26.7 (137) CAG 27.7 (142) CGG 4.1 ( 21) AUU 30.5 (156) ACU 8.0 ( 41) AAU 21.9 (112) AGU 7.2 ( 37) AUC 18.2 ( 93) ACC 22.8 (117) AAC 24.4 (125) AGC 16.6 ( 85) AUA 3.7 ( 19) ACA 6.4 ( 33) AAA 33.2 (170) AGA 1.4 ( 7) AUG 24.8 (127) ACG 11.5 ( 59) AAG 12.1 ( 62) AGG 1.6 ( 8) GUU 16.8 ( 86) GCU 10.7 ( 55) GAU 37.9 (194) GGU 21.3 (109) GUC 11.7 ( 60) GCC 31.6 (162) GAC 20.5 (105) GGC 33.4 (171) GUA 11.5 ( 59) GCA 21.1 (108) GAA 43.7 (224) GGA 9.2 ( 47) GUG 26.4 (135) GCG 38.5 (197) GAG 18.4 ( 94) GGG 8.6 ( 44)

17 Vergelijking van kodewoordgebruik in E
Vergelijking van kodewoordgebruik in E. coli genen met hoog of laag expressieniveau "strong" : 24 genen (5253 triplets), waaronder 12 voor ribosomale eiwitten, 7 voor buitenmembraaneiwitten en een aantal voor RNA polymerase en translatie-initiatie- en terminatiefactoren. "weak" : 18 genen (5231 triplets), voor o.a. verschillende repressoreiwitten, lac-permease (LacY), e.a.

18 (dit kan matuur proteïne of fusieconstruct zijn)
- immunochemische methoden : rechtstreeks op expressie product (epitoop) (dit kan matuur proteïne of fusieconstruct zijn) => binding aan polyvinylplaten (kolonies) of aan cellulosenitraat membranen (l-plaques) => oorspronkelijk met 125I-gemerkte IgG als sonde => nu, enzymatische merking van het antilichaam (vb. alkalische fosfatase) primair antilichaam tegen het doelwit, secondair (gemerkt) antilichaam om het gebonden primair antilichaam te detecteren => gebruik van ofwel polyklonale antilichamen of monoclonaal antilichaam - indirecte benaderingen : louter gebaseerd op “activiteit” (translatie in vitro tot actief eiwit) - HArT (‘hybrid arrested translation’) - in vitro translatie van mRNA extract => selectieve inhibitie van translatie door complementair DNA - HST (HRT) (‘hybrid-selected translation’, ‘hybrid-released translation’) - affiniteitsselectie en her-elutie van de ‘positieve’ activiteit => pools van clones, stapsgewijs reduceren tot enkelvoudige kloons

19 Antibodies : (a) Antilichamen binden aan "vreemde" moleculen en
helpen bij hun afbraak. (b) Gezuiverde antilichamen ("antisera") kunnen bekomen worden (o.a.) uit een kleine hoeveelheid bloed van een konijn dat geïnjecteerd was met het "vreemde" proteïne.

20 Immunoscreening Detectie door : - het gemerkte antilichaam zelf of
- gemerkt proteïne A (zoals in deze figuur) - gebruik van een tweede antilichaam dat specifiek bindt aan het primaire antilichaam.

21 "Sandwich"-benadering bij
analyse met antilichamen als sonde.

22 Plaque screening van kloons
van fusieproteïnen (aan LacZ) met behulp van antilichamen.

23 cDNA klonering : overzicht van werktuigen / strategieën / procedures
Activiteit aminozuursequentie CEL Antisera reverse translatie proteïne extract Sonde Tumorlijn Inductie Natuurlijke condition mRNA in vitro translatie Chemische DNA synthesis TEST oligo-dT chromatografie polyA+ mRNA cDNA klonering kloons Hybridisatie DNA sequencing Expressie / productie EST banken HART HST cDNA klonering : overzicht van werktuigen / strategieën / procedures

24 Hybrid arrested translation (HArT)
Wat indien geen (enkele) informatie beschikbaar is? Hybrid arrested translation (HArT) mRNA extract analyse voeg gedenatureerd plasmide DNA analyse activiteit toe van 1 of meer cDNA kloons activiteit in vitro translatie proteïne biochemische in vitro translation test proteïne test Het plasmide DNA van de cDNA kloon die de biologische activiteit inhibeert in de biochemische test is een goede kandidaat-positieve kloon. Pools van DNAs worden simultaan getest, en vervolgens opgesplitst in kleinere aantallen, totdat individuele kloon DNAs kunnen getest en geanalyseerd worden.

25 Hybrid selection translation (HST)
mRNA wordt geselecteerd uit een totaal mRNA extract door hybridisatie op een geïmmobiliseerd cDNA plasmide kloon DNA. In vitro translatie van het geselecteerde mRNA (na elutie) geeft proteïneproduct dat in de biochemische test geanalyseerd wordt. Positief signaal wijst naar de gewenste kloon.

26 vergelijking-gericht
- ‘abundance screening’ : klonering egaliseert grosso modo de hoeveelheid DNA van de inserts in de respectievelijke cel maar : het aantal kloons van een mRNA komt nu overeen met de relatieve concentratie van een mRNA in de populatie - in genoombanken : genfamilies - in cDNA banken : hoge vs lage abundantie van mRNA’s - differentiële expressie en ‘difference screening’ : enkele voorbeelden - Xenopus laevis gastrula versus egg mRNA - vergelijking tussen blad – wortel – stam – enz. bij planten - planten in licht of in ‘t donker / - inductie - substractieve technieken (screening/klonering) - mRNA en cDNA zijn steeds complementair : er is dus geen complementariteit tussen mRNA's van verschillende oorsprong er is dus geen complementariteit tussen cDNA's van verschillende oorsprong - sondes met positieve (na substractie) of negatieve (vergelijking) identificatie

27 “Abundance screening”
Hybridisatie met sondes uit een cDNA bank om de abundante genen (of mRNAs) te identificeren.

28 "differential expression analysis"
"Difference screening" & "differential expression analysis" Meerdere DNA-filters worden in parallel gemaakt en vergeleken na hybridisatie met verschillende sondes. Gemerkte of geëtiketteerde cDNA copies van mRNA populaties van verschillende soorten cellen of celtypes, of na groei onder diverse condities, of na inductie of andere behandelingen.

29 Substractieve technieken : vergelijking van celtypes
mRNA bereid uit celtype A. mRNA bereid uit celtype B. cDNA bereid op mRNA van celtype A, enkelstrengig na alkalische behandeling. Het cDNA is complementair aan het mRNA, ook deze van celtype B voor zover deze in celtype B tot expressie komen. => renaturatie van cDNA(A) met mRNA(B) geeft hybriden, maar sequenties die beide celtypes niet gemeenschappelijk hebben blijven enkelstrengig. mRNA en RNA-DNA hybriden binden aan hydroxyapatiet (d.i. Ca5(PO4)3(OH)). Celtype A-specifiek cDNA kan worden geïsoleerd en gebruikt hetzij om een A-specifieke cDNA bank aan te maken, hetzij om als sonde gebruik te worden om een volledige cDNA bank van celtype A te screenen.

30 Vergelijking van cellen voor en na inductie.
Stappen in differentiële hybridisatie screening procedures. +/- strategie : vergelijking van signalen bekomen met replica filters, na hybridisatie met materiaal afgeleid van cellen in respectievelijk een geïnduceerd en niet-geïnduceerd stadium. Stippellijnen : strategie met "gesubstracteerde" sondes, aangerijkt in sequenties die specifiek onder inductie- omstandigheden aanwezig zijn. Directe identificatie van de "positieve" kloons.

31 vergelijking-gericht (vervolg)
- ‘differential display’ (PCR benadering) - cDNA-synthese start met een oligonucleotide zoals 5’-TTTTTTTTVN-3 (1 van 12) - terugpriming met nonameren (of hexameren or decameren) - amplicatie door “toeval” : => uitfiltering tot detecteerbaar aantal signalen na gelfractionatie => verschillen vereisen nauwkeurige bevestiging - ESTs : random DNA sequencing van kloons uit de bank : nt als etiket (‘expressed sequence tag’) - systematische sequentieanalyse van cDNA kloons (inserts) - oriëntatie-"probleem" - uitsortering (contig-vorming) - voordeel : routinematig karakter ; relatieve eenvoud - nadeel : werkintensief en duur door de grootschaligheid enigszins overmatig t.o.v. van de gewonnen informatie - EST-banken eerder globaal per organisme dan per conditie

32 "Differential display" analyse

33 vergelijking-gericht (vervolg)
- RDA (‘representational difference analysis’) - genoom vergelijking - cDNA vergelijking => selectieve amplificeerbaarheid verwezenlijken van hetgeen niet gemeenschappelijk is door manipulatie van de fragmentuiteinden. => 'tester' (doelwit) en 'driver' (het selecterende agens : in overmaat) => alleen de unieke testerfragmenten hebben een PCR-primersequentie aan beide uiteinden - SAGE : aaneenschakelen van korte etiketten (9-20 bp), één etiket per mRNA (“serial analysis of gene expression”) representatie van de mRNA-moleculen door een kort etiket ('tag') => er zijn meer dan nonameer-etiketten > < er zijn maximaal slechts een paar tienduizend mRNA's - etiket => moet voldoende lang zijn om selectief (en informatief) te zijn => moet voldoende kort zijn om aantal sequentieanalyses te beperken door concatenatie van de etiketten - nadeel : heel wat manipulaties om een 'tag library' aan te maken - voordeel : zeer kwantitatieve analyses zijn mogelijk (tienduizenden tags zijn haalbaar ; frequentiemeting door telling) - initëel : op basis van FokI : etiket 9 + 4 - verdere ontwikkeling naar grotere etiketten => long-SAGE - balans tussen (meer) informatie en (meer) sequentieanalyses

34 RDA uit : Primrose & Twyman

35 RDA : aanmaak van tester en driver DNA
Restrictiesplitsing van cDNA staal (gemiddelde grootte van fragmenten >200 bp) "Anneal " en ligeer een 12/24 linker cassette (bovenste streng alleen aan linkerzijde onderste streng alleen aan rechterzijde) Verwijder het 12-meer en vul in tot even uiteinden PCR amplificatie geeft een grote hoeveelheid aan tester en driver DNA RDA : aanmaak van tester en driver DNA (synthetische) linkers zijn niet gefosforyleerd

36 RDA Karakteriseer de amplificatieproducten Tester Driver
Verwijder de eerste adaptor door restrictiesplitsing Koppel een tweede adaptor (zoals de eerste) maar alleen aan het tester DNA Meng tester en driver in a 1/100 verhouding. Denatureer en re-associeer. Invulreactie met DNA polymerase Tester / Driver lineaire amplificatie Tester / Tester exponentiële amplificatie Driver / Driver geen amplificatie PCR amplificatie met de primers die overeenkomen met de tweede adaptor (of gedeelte ervan) Karakteriseer de amplificatieproducten Tester Driver

37

38 Algemene basis van SAGE. 'Anchoring' enzym : NlaIII
'Tagging' enzym : FokI (zie details op volgende slide)

39 Elk mRNA is vertegenwoordigd door één tag : deze ligt, kijkend
vanaf de poly(A) staart, bij het eerste voorkomen van een NlaIII knipplaats. FokI splitst op posities 9/13 : het 4-nt uiteinde wordt ingevuld door DNA polymerase. (het 14/18 fragment komt los van de parels en wordt nu ingevuld tot 18-bp even fragmenten) Ligatie (van even uiteinden) koppelt twee 18-bp fragmenten tot 36-bp en splitsing met NlaIII reduceert deze tot 18-bp met extra 3'-CATG-uiteinden aan beide zijden. De tags worden paarsgewijs geligeerd in de vector. De paren zijn bijgevolg gescheiden door een CATG (en kunnen aldus geïdentificeerd worden).

40 Tel voor elke tag het aantal keer dat hij voorkomt in de sequenties.

41 Voorbeeld van een SAGE tag analyse in gist (S. cerevisiae)