Andere vectoren Genomische DNA bank cDNA synthese PCR

Presentatie over: "Andere vectoren Genomische DNA bank cDNA synthese PCR"— Transcript van de presentatie:

1 Andere vectoren Genomische DNA bank cDNA synthese PCR
Kloneren; vervolg 1 Andere vectoren Genomische DNA bank cDNA synthese PCR

2 Kloneren in een plasmide
Voor kloneren (recombinant DNA of genetic engineering) is nodig: Vector Restrictie enzym (en) Ligase DNA (om te kloneren) Gastheercellen Methode om DNA in gastheercel te krijgen Selectiemarker Welke andere soorten vectoren zijn er?

3 Vectoren In een plasmide kan een DNA fragment van maximaal bp worden gekloneerd. Voor grotere DNA fragmenten zijn andere vectoren beschikbaar: Faag λ DNA BACs YACs -shuttle vectoren -expressie vectoren

4 Faag lambda Lysogene cyclus
De levenscyclus van faag lambda kent 2 cycli: de lytische cyclus en de lysogene cyclus Plaques; faag lambda die op/ in E.coli groeit.

5 Faag λ als vector Het DNA van (Bacterio) faag λ is 48.502 bp.
1/3e daarvan is niet nodig. Dit kan worden vervangen door DNA dat je wilt kloneren (± bp). DNA van bp wordt door het “in vitro packaging” systeem ingebouwd in virusdeeltjes. De infectie van E. coli cellen (transfectie) met virusdeeltjes is veel efficiënter dan transformatie.

6 BAC Bacterieel Artificieel Chromosoom
Een BAC is een plasmide waarin enorm grote DNA fragmenten kunnen worden gekloneerd. Een BAC bevat: een ORI par genes LAC Z gen (waarin gekloneerd wordt) CmR DNA fragmenten van – bp Via electroporatie in E. coli.

7 Kloneren in een YAC Yeast Artificieel Chromosoom
Een YAC is een plasmide waarin enorm grote DNA fragmenten kunnen worden gekloneerd. Een YAC wordt gebruikt voor transformatie van eukaryotische gistcellen. Een YAC bevat: Een gist ORI 2 selectie markers (1 in iedere arm) TEL sequenties CEN sequenties DNA fragmenten van – bp Via transformatie in Gist sferoplasten. DNA fragmenten kleiner dan bp zijn instabiel.

8 Kloneren in eukaryotische cellen
Voor transformatie van hogere eukaryoten worden nog weer andere vectoren gebruikt en andere transformatie-methoden. Dit komt in MBI21 aan bod.

9 Shuttle vectoren Een shuttle vector is een vector die in meerdere organismen gebruikt kan worden. Meerdere ORI’s Meerdere selectiemarkers Waarom?

10 Expressie vectoren Een expressie vector wordt gebruikt als men van het gekloneerde DNA eiwit wil laten maken in de getransformeerde cellen. Details worden in college 6 besproken.

11 Welk DNA wordt gebruikt om te kloneren?
Genomisch DNA cDNA PCR-DNA Genomisch DNA wordt partieel gedigesteerd met een RE; Wat is partiële digestie? Waarom wil je dat? Hoe krijg je partiële digestie Welk enzym?

12 Hoe vaak knipt een RE? Als elke base even vaak voorkomt in het DNA, hoe vaak (om de hoeveel basenparen) knipt dan EcoRI? EcoRI herkent 5’ GAATTC In hoeveel fragmenten knipt humaan genomisch DNA met het RE EcoRI?. Het humane genoom is 3 x 109 bp 3x109/4096 = 732 x 103 1 op 46= 1 op 4096 Dus ongeveer om de 4096 bp

13 Waarom partiële digestie
Overlappende fragmenten, zodat na kloneren de volgorde van de DNA fragmenten kan worden vastgesteld. STS markers De verzameling recombinant bacteriën of plaques of gistcellen met daarin een heel genoom wordt een genomische DNA bank genoemd.

14

15 Genomische DNA bank maken
Isolatie van genomisch DNA Fragmentatie van het DNA door: Pipetteren Vortexen Sonicatie Veel DNA fragmenten hebben nu blunt ends Alle fragmenten blunt ends door: opvullen met Klenow Polymerase (mist 3’ ’ exo) Linkers ligeren en knippen (dia 27) In vector ligeren

16 Selectie van DNA fragmenten van bepaalde grootte
Pulse field-gel electroforese

17 Isolatie van DNA fragmenten uit agarose

18 Welk DNA wordt gebruikt om te kloneren
Genomisch DNA cDNA PCR-DNA cDNA = complementary DNA Hoe wordt het gemaakt Waarom wil je dat? Welke enzymen?

19 Wat is cDNA??? cDNA betekent complementary of copy DNA
Voorbeeld van cDNA synthese zie ook dia 22 cDNA betekent complementary of copy DNA Het is DNA dat in vitro gemaakt is op mRNA mRNA wordt alleen gemaakt wanneer genen tot expressie komen. mRNA

20 Waarom cDNA? In genomisch DNA zit veel niet-koderend DNA.
Exon = koderend DNA Intron = niet-koderend DNA mRNA bevat de introns niet meer, maar nog wel de voor het eiwit coderende sequentie. Een cDNA bank bevat dus minder DNA dan een genomische DNA bank en bevat uitsluitend DNA dat codeert voor eiwitten. Een cDNA bank is orgaan- en organisme specifiek.

21 Wanneer kan DNA Polymerase starten met de synthese?
Alle DNA-polymerases hebben nodig: Een voorbeeld DNA streng = matrijs Een dubbelstrengs deel De laatste nucleotide aan dat dubbelstrengs deel heeft een vrij 3-OH dNTPs

22 cDNA synthese op eukaryotisch mRNA
dwb.unl.edu/.../~dbl0www/ Staff/Croy/cDNAfigs.htm Eukaryotisch mRNA eindigt (bijna) altijd met een poly-A staart DNA polymerase heeft een ds startpunt nodig Als primer kan dan een oligo T primer gebruikt worden Als DNA polymerase wordt een reverse transcriptase gebruikt Er ontstaat een RNA/DNA hybride RT (reverse transcriptase) maakt DNA op RNA maar ook op DNA.

23 cDNA synthese vervolg Van de RNA/DNA hybride wordt het RNA afgebroken
Hiervoor wordt NaOH gebruikt of het enzym RNAse H RNAse H verbreekt de fosfodiester binding tussen 2 nucleotiden in RNA in een RNA/DNA hybride. Vervolgens kan er ds DNA van worden gemaakt De ds loop wordt met S1-nuclease open geknipt.

24 cDNA synthese Er zijn meerdere mogelijkheden om de cDNA synthese te starten op mRNA: Een oligo-T primer Een specifieke primer Een random primer Een primer is een enkelstrengs stuk(je) DNA, meestal synthetisch gemaakt, dat kan baseparen met het mRNA of met de enkelstrengs DNA streng.

25 cDNA synthese; een alternatieve methode voor de 2e DNA streng.

26 Kloneren van cDNA Het ds cDNA is blunt
Op deze manier kan het in een vector (met ook blunt uiteinden) worden gekloneerd Efficienter is het om eerst linkers aan het blunt DNA te ligeren (die na digestie sticky uiteinden opleveren) Kloneren van cDNA

27 Linker DNA Linkers zijn korte stukjes DNA (10 – 14 nt)= oligont’s) die de herkenningssequentie van een RE bevatten Door een enorme overmaat linkers aan het ds blunt cDNA toe te voegen ligeren er vaak meerdere linkers aan het DNA. Vervolgens wordt gedigesteerd met het RE en heeft het cDNA toch een sticky uiteinde gekregen. Linkers worden synthetisch gemaakt en worden dan ook wel synthetisch DNA genoemd.

28 DNA tailing Een andere methode om sticky uiteinden aan het DNA te krijgen is: Homopolymeer-tailing. Elke nucleotide (dCTP, DTTP, DATP en dGTP) kan gebruikt worden om een tail te maken. Er moet aan het 3’ -uiteinde van het blunt ds DNA wel een OH groep zitten. (waarom???)

29 Welk DNA wordt gebruikt om te kloneren
Genomisch DNA cDNA PCR-DNA PCR = Polymerase Chain Reaction Hoe werkt de PCR? Voordelen en nadelen Welke enzymen?

30 Kloneren van PCR-DNA Het PCR product eindigt meestal met een 3’-A.
Voordeel PCR = snel Nadeel PCR = kleine DNA fragmenten (tot 2000 bp) DNA kan fouten bevatten omdat veel DNA-polymerases (die voor PCRen worden gebruikt) geen proofreading activiteit bevatten.

31 PCR = Polymerase Chain Reaction
Een snelle, (vrij) goedkope, methode waarmee -in korte tijd (paar uur) -een specifiek stuk DNA (of RNA) -in vitro miljoenen keren vermenigvuldigd kan worden. De PCR reactie lijkt erg op de replicatie van DNA zoals die in de natuur plaatsvindt

32 DNA replicatie Elk nieuw stukje DNA start met een RNA- primer.
Nadat de DNA-synthese door DNA afhankelijk DNA polymerase is begonnen, wordt het RNA verwijderd (RNase = endonuclease). De gaten (gaps) worden daarna met dNTPs opgevuld door (een ander) DNA polymerase. Bij eukaryoten zijn meerdere DNA polymerases actief. De synthese van de DNA stukjes in de lagging strand worden Okazaki fragmenten genoemd.

33 De PCR reactie werd in 1983 door Kary Mullis ontwikkeld
Kary Mullis kreeg voor de ontwikkeling van de PCR in 1993 de Nobelprijs voor Chemie Het idee is simpel: 1: Maak het ds DNA ss 2: Laat op elke streng een primer annealen (binden) (= startpunt voor DNA Polymerase) 3: Laat DNA polymerase de primers verlengen zodat er twee ds DNA strengen ontstaan Stap 1, 2 en 3 vormen samen 1 cyclus. Herhaal de stappen 1, 2 en 3 20 – 40 x

34 De PCR cyclus: Het denatureren van het DNA gebeurt bij
± 94 °C, 20 – 30 seconden is vaak al genoeg. De primer annealing vindt meestal plaats bij een temperatuur die tussen de 50 en 60 °C inligt De synthese vindt plaats bij 72 °C. De tijdsduur is afhankelijk van de lengte van het te synthetiseren DNA.

35 Per PCR cyclus wordt het DNA een factor 2 vermenigvuldigd.
Na 20 cycli is dat….. 220 = x Na 25 cycli is dat…. 225 = x De vermenigvuldigings-factor is onder ideale omstandigheden in principe 2n. Het gemaakte DNA fragment (PCR product) wordt ookwel amplicon of amplimeer genoemd

36 Is de PCR verlopen zoals je deze had geprogrammeerd?
Van het verloop van alle stappen van de PCR kan een zogenaamd temperatuurprofiel gemaakt worden. Het temperatuurverloop in een epje wordt dan zoals hiernaast weergegeven. De tijd die nodig is om van de ene T naar de andere te komen wordt de ramptijd genoemd.

37 De ingredienten van een PCR reactiemix
Template DNA (monster) primer 1 en primer 2 dNTPs Buffer inclusief Mg2+ Gelatine, BSA, Tween, Triton, DMSO (1 of meerdere hiervan) Taq Polymerase (thermostabiel DNA polymerase. uit Thermophilus aquaticus. Dit polymerase werkt optimaal bij 75 – 80 °C, en hoeft maar 1 keer aan de reactiemix te worden toegevoegd.

38 Hoe weet je dat de PCR gelukt is??????
Hoe weet je of er een PCR product is gemaakt??? Hoe weet je of dat het correcte product is????? Na de PCR kan een deel van het reactiemengsel in een agarosegel ge-electroforeerd worden.

39 De Primers Moeten uniek zijn!! Lengte 18 – 25 nt’s Hoe vaak komt de sequentie van een primer van 18 nt voor in het DNA van bv. de mens (3 x 109 bp)? Het GC gehalte moet bij voorkeur tussen de 40 en 60% De overmaat aan primers t.o.v. matrijs DNA = 107 , maar een te hoge concentratie aan primers kan aspecifike producten opleveren. Voorkom interne baseparing Voorkom baseparing tussen de twee verschillende primers; het gevolg kan een primer-dimer zijn Mismatches mogen (dit worden gedegenereerde primers genoemd) ……..maar niet aan de 3’-kant. 3’-kant bij voorkeur 2 GC baseparen

40 De Primers De ene primer (groen) wordt de forward primer genoemd, de andere de reversed. Primers kunnen aan de 5’-kant verlengd worden met nt die niet baseparen!!!! In deze “tail” kan de sequentie zitten voor: een restrictie enzym, voor een promotor, ….. De annealings temperatuur (Ta) kan stringent of minder stringent worden ingesteld (stringency (strengheid) Hoe hoger de Ta t.o.v. de berekende Tm des te stringenter. Bij een stringente Ta neemt de kans op a-specifieke producten af,…..maar de opbrengst kan ook afnemen. Forward primer Reversed primer

41 -Te veel Mg 2+ het dsDNA stabiliseert
De rol van MgCl2 Taq DNA polymerase heeft Mg2+ ionen nodig als cofactor. D.w.z. zonder Mg2+ functioneert het enzym niet! Een optimale concentratie is belangrijk omdat: -Te veel Mg 2+ het dsDNA stabiliseert -Te weinig Mg 2+ de DNA synthese remt De Mg concentratie wordt meestal experimenteel vastgesteld!!!

42 Taq Polymerase Het oorspronkelijke Taq polymerase werd uit de Archae-bacterie Thermophilus aquaticus geisoleerd. Optimale synthese temperatuur = °C Synthese snelheid: 35 – 150 nt/sec T½ = 40 ‘ bij 94 °C Geen 3’ → 5’ exonuclease activiteit Afhankelijk van Mg 2+ Afhankelijk van K+ Geschikt voor fragmenten tot 3 kb (langer kan wel, maar geeft minder product) Tegenwoordig zijn ook gekloneerde varianten verkrijgbaar. Amplitaq is daar een voorbeeld van.

43 DNA Polymerases voor PCR
3'->5' Exonuclease Source and Properties Taq No From Thermus aquaticus. Halflife at 95C is 1.6 hours. Pfu Yes From Pyrococcus furiosus. Appears to have the lowest error rate of known thermophilic DNA polymerases. Vent From Thermococcus litoralis; also known as Tli polymerase. Halflife at 95 C is approximately 7 hours.

44 Er zijn thermostabiele DNA polymerases die enorm lange fragmenten kunnen maken
Lane 1: Mixture of molecular weight marker II and a lambda DNA / Xho I digest Lane 2: 12 kb (8 min elongation) Lane 3: 15 kb (12 min elongation) Lane 4: 18 kb (15 min elongation) Lane 5: 24 kb (20 min elongation) Lane 6: 27 kb (23 min elongation) Lane 7: Mixture of molecular weight marker II and a lambda DNA / Xho I digest. Voor deze PCR op Humaan genomisch DNA werd het enzym “expand long template” gebruikt

45 Ampli Taq Gold Deze variant van ampli Taq is inactief totdat de temperatuur 95 °C is. Volledig actief is het enzym pas na 10 minuten. Een verhittingsstap voorafgaande aan de PCR cycli wordt ook wel een “Hot start” genoemd. Voordelen van een hot start zijn: Minder mispriming Grotere gevoeligheid voor low copy monsters Hogere opbrengst product De matrijs is volledig enkelstrengs!

46 Einde van de PCR reactie
De laatste elongatie stap (synthese stap) van de PCR wordt vaak verlengd. Het nog actieve DNA polymerase kan dan incomplete DNA strengen als nog verlengen. De allerlaatste stap is afkoelen en op 4°C houden.