RFLPs SNPs Micro-array

Presentatie over: "RFLPs SNPs Micro-array"— Transcript van de presentatie:

1 RFLPs SNPs Micro-array
DNA technieken RFLPs SNPs Micro-array

2 RFLPs (Riflip) RFLP = Restrictie Fragment Lengte Polymorfisme
Bij het vergelijken van twee dezelfde stukken DNA met elkaar (bv. hetzelfde chromosoompaar) kunnen er na digestie met Restrictie enzymen toch verschillen ontstaan. Dit wordt een RFLP genoemd RFLP = Restrictie Fragment Lengte Polymorfisme

3 Hoe ontstaat een RFLP Een RFLP ontstaat door een mutatie:
Een insertie (meer dan 1) Een deletie (meer dan 1) Een duplicatie Een puntmutatie Door die mutatie ontstaat of verdwijnt er een RE site of wordt de afstand tussen 2 RE sites groter of kleiner

4 RFLPs zijn erfelijk M en P zijn de moeder en de vader. Zij kregen samen 11 kids. Bij ieder kind is het RFLP patroon afkomstig van beide ouders…… maar van elke ouder is maar 1 chromosoom aanwezig. Het RFLP patroon van kinderen van dezelfde ouders kan daardoor verschillen. Hoe meer RFLPs bekeken worden des te groter de kans dat er voor ieder kind een uniek patroon wordt gevonden.

5 Soms is een RFLP te gebruiken als marker voor een genetisch defect.
In het HB gen zit een RFLP. Door de RFLP zichtbaar te maken kan worden aangetoond of iemand drager is of beide allelen voor de ziekte heeft. Vaak zit een RFLP naast een gen. Als er sprake is van koppeling, kan een erfelijke eigenschap gevolgd worden.

6 Hoe kan je een RFLP zichtbaar maken???
Methode I: Knippen, electroforeren in agarose, southern blotten en hybridiseren. Methode 2: PCR-en van het stuk DNA waarin de RFLP valt, knippen en electroforeren

7 Wanneer je genomisch DNA knipt en electroforeert kan je geen DNA fragmenten onderscheiden.
Na blotten en hybridiseren wel Methode I

8 Methode 2 Soms is PCR-en alleen al voldoende om een RFLP aan te tonen.
In dit geval gaat het om repeterende sequenties die veel in het genoom voorkomen; de VNTR (variable number of tandem repeats) De afstand tussen 2 RE- sites varieert doordat het aantal repetities varieert Dit zijn doorgaans nogal variabele gebieden, waardoor verschillen per persoon kunnen ontstaan

9 http://www. ornl. gov/sci/techresources/Human_Genome/elsi/forensics
De gevonden RFLPs worden vervolgens zoals hiernaast en hieronder weergegeven.

10 Genetische kaart en Fysische kaart
Een genetische kaart is een schematische maar zo gedetailleerd mogelijke kaart (map) van een genoom met daarop zoveel mogelijk genen gepositioneerd t.o.v. elkaar. Het is een relatieve map. Afstanden zijn in cM. Een fysische kaart bevat zoveel mogelijk markers (RE sites, RFLPs, SNPs,…). Afstanden zijn in bp (kbp, Mbp). Voor beide mappen geldt dat de sequentie niet bekend hoeft te zijn. Doordat nu globaal de sequentie van het humane genoom bekend is kunnen beide mappen gecombineerd worden.

11 Landmarks of tags; de SNP
De markers op een fysische kaart worden ookwel tags genoemd. Een veelvoorkomende tag is de SNP (snip). Een SNP is een single nucleotide Polymorfisme, = 1 nt. die anders is. Een dergelijke puntmutatie wordt een SNP genoemd als hij bij minimaal 1% van de populatie voorkomt. Een SNP kan een RFLP veroorzaken, maar dat is lang niet altijd het geval Een SNP kan gekoppeld worden aan een ziekte Hiernaast zijn 8 SNPs gevonden mbv sequencen.

12 RFLPs kunnen ook gebruikt worden als marker op een fysische kaart van het genoom

13 Micro-array analyse

14 Micro-array Omdat het om expressie van genen gaat wordt:
M.b.v. de Micro-array techniek kan de activiteit van duizenden genen tegelijk bestudeerd worden Het gaat daarbij altijd om een vergelijking van minimaal 2 situaties; bv. een gewone cel en een tumorcel of hoe een cel of bacterie reageert op een bepaalde stof Omdat het om expressie van genen gaat wordt: mRNA uit de te bestuderen cellen geisoleerd. Hierop wordt gelabeld cDNA gemaakt Hybridisatie uitgevoerd met duizenden oligo’s tegelijk!!!! Mbv laserlicht wordt de hybridisatie bekeken

15 Micro-array of cDNA

16 Het maken van een micro-array
Het aanbrengen van het DNA op het glasplaatje gebeurt met een robot

17 Het principe van de methode

18 Een voorbeeld van een micro-array-analyse na hybridisatie
Als alleen het groene cDNA hybridiseerd licht dat spotje groen op Als alleen het andere cDNA hybridiseerd licht dat spotje alleen rood op Hybridiseren beide cDNAs aan hetzelfde spotje dan wordt het een mengkleur, bv. geel. Op deze manier is de activiteit van genen zichtbaar te maken Het wordt bv. toegepast om de activiteit van genen bij borsttumoren in kaart te brengen.