Modificerende enzymen

Presentatie over: "Modificerende enzymen"— Transcript van de presentatie:

1 Modificerende enzymen
Kloneren Plasmiden Restrictie-enzymen Ligatie Transformatie Selectie Modificerende enzymen

2 Kloneren in een plasmide
Kloneren: om veel DNA of veel product te krijgen van een bepaald gen. Voor kloneren (recombinant DNA of genetic engineering) is nodig: Vector Restrictie enzym (en) Ligase DNA (om te kloneren) Gastheercellen Methode om DNA in gastheercel te krijgen Selectiemarker

3 Het autonoom repliceren van een plasmide houdt in dat het plasmide vaker repliceert dan dat de bacterie zich deelt. Zo ontstaan er meer kopieën van het plasmide per bacterie.

4 Gastheercellen Als gastheercellen worden
meestal E. coli cellen gebruikt, omdat er veel van het DNA en van de cellen bekend is en het zeer snelle groeiers zijn. Andere prokaryoten: ……….. De eenvoudigste eukaryoten (Saccharomyces cerevisiae) worden ook veel gebruikt, omdat …. (zie E. coli). Andere eukaryotische cellen, bv. Hela cellen. Gist cellen Hela cellen

5 Vectoren Vectoren zijn nodig om het te kloneren DNA in de nieuwe gastheer cel te brengen. Een plasmide kan als vector gebruikt worden. Plasmiden komen van nature voor in prokaryoten en in gist. Plasmiden zijn “high copy” of “low copy”. Plasmiden zijn nuttig voor de bacteriën, maar niet noodzakelijk. Meestal bevatten ze een bepaalde eigenschap, zoals een resistentie tegen een antibioticum. Plasmiden bevatten een ORI. De grootte varieert tussen de 5000 en bp.

6 Plasmiden Om bruikbaar te zijn bij een klonering moet het plasmide:
Een ORI bevatten 1 of meer unieke restrictie sites hebben 1 of meer selectie markers hebben Het zijn natuurlijke plasmiden die gemodificeerd zijn. Vb: pUC18/19 Unieke restrictie sites) Selectiemarker (resistentiegen tegen het Antibioticum ampicelline) ORI

7 Om te kloneren zijn restrictie enzymen nodig!
Restrictie enzymen zijn endo (desoxyribo) nucleasen (RE’s). Zij knippen tussen 2 nucleotiden de suiker-fosfaat ruggegraat kapot. Dit in tegenstelling tot de exonucleasen (denk aan DNA polymerase met zijn 3 activiteiten) die aan het 5’- of juist aan het 3’-uiteinde van een DNA-keten beginnen met weghalen van nucleotiden.

8 Replicatie (synthese) van DNA (uit PPT 1)
Het DNA afhankelijk DNA polymerase heeft nodig: een matrijs een 3`OH -groep aan een stukje ds DNA En dNTPs. De energie die vrij komt bij afsplitsing van twee fosfaatgroepen maakt de binding van de nucleotide aan het 3` OH mogelijk. De syntheserichting van DNA is (gezien vanuit de te synthetiseren streng) van 5`naar 3`.

9 Restrictie-enzymen Er zijn 3 types RE’s:
I: herkent een sequentie en knipt duizenden nucleotiden verder II: herkent een palindroom sequentie en knipt daarin of daarnaast III: herkent een sequentie en knipt 25 – 30 nt verder. Omdat het er bij recombinant DNA technieken om gaat dat op 1 specifieke plaats in het DNA geknipt moet worden, wordt type II RE gebruikt

10 Hoe zijn restrictie enzymen ontdekt?
Restrictie enzymen beschermen de bacterie tegen binnenkomend vreemd DNA Het eigen DNA wordt beschermd door een modificatie=er worden op speciale plaatsen in het DNA methylgroepen aangebracht (op de C). Dit wordt het restrictie-modificatie systeem van de bacterie genoemd.

11 Hoe zijn de plaatsen waar restrictie enzymen knippen te herkennen?
Restrictie sites zijn te herkennen aan hun interne symmetrie en aan hun palindroom structuur Eco RI herkent 5’GAATTC in beide strengen en knipt deze sequentie na de eerste G. Na de digestie zijn er sticky uiteinden ontstaan Deze sticky uiteinden wijzen naar de 5’kant, en worden dan ook 5’-overhangende sticky uiteinden genoemd.

12 Enkele voorbeelden van restrictie-enzymen
Na het knippen kunnen de sticky uiteinden 5’- overhangend of 3’-overhangend zijn. Het resultaat kan ook blunt (= stomp) zijn (zie PVUII). R = Pu, Y = Py, N = alles Naamgeving

13 Digestie en Ligatie Na digestie met een RE
kunnen de sticky uiteinden weer met elkaar baseparen (annealen). De herkomst van het DNA waar de sticky uiteinden aan zitten speelt daarbij geen rol. Het enzym Ligase kan de suiker-fosfaat band weer herstellen (net als bij de replicatie, denk aan de Okazaki fragmenten). Zo kan een stuk vreemd DNA in een plasmide geligeerd worden.

14 Ligeren en Ligase ligase is het enzym dat twee DNA
fragmenten aan elkaar plakt (de fosfodiesterband weer hersteld). Blunt uiteinden ligeren veel minder efficiënt dan sticky uiteinden.

15 Recombinant DNA Door twee verschillende stukken DNA te ligeren ontstaat een recombinant DNA molecuul. Het RE of de RE’s waar mee geknipt wordt hoeven niet hetzelfde te zijn, maar moeten wel compatibele sticky uiteinden opleveren.

16 Verschillende Restrictie enzymen met compatibele uiteinden:
Andere herkenningssite, compatibele uiteinden: Voorbeeld: XmaI en (C↓CCGGG) en NgoMIV (G↓CCGGC) C CCGGG en G CCGGC GGGCC C CGGCC G Vraag: Zijn dit 3’ of 5’ overhangende uiteinden? GCCGGG en CCCGGC CGGCCC GGGCCG De oorspronkelijke enzymen XmaI en NgoMIV kunnen de geligeerde sequentie niet meer herkennen/knippen.

17 Isoschizomeren en Neoschizomeren:
Gelijke herkenningssite en knipplaats: isoschizomeren Voorbeeld: RcaI T/CATGA BspHI R0517 BspHI, CciI, PagI RgaI GCGAT/CGC AsiSI R0630 AsiSI, SfaAI, SgfI RigI GGCCGG/CC FseI R0588 Gelijke herkenningssite en andere knipplaats: neoschizomeren NlaIII CATG/ R0125 CviAII^, FatI^, Hsp92II CviAII^ R0640 C/ATG FatI^ R0650 /CATG

18 Bij de ligatie kunnen meerdere verschillende recombinant DNA moleculen ontstaan.
Er komt bij de transformatie maar 1 plasmide in een gastheercel terecht. Door een juiste selectie kan de cel met het recombinant plasmide gevonden worden.

19 Kloneren in plasmide pBR322 en selectie
Het oudste plasmide = pBR322 Er werd gekloneerd in 1 v/d 2 antibioticum resistentie genen. Bij de transformatie komt maximaal 1 plasmide in een E. coli cel terecht. De transformatie-efficiëntie is laag Via de selectie (2 x) kan onderscheid gemaakt worden tussen bacteriën met pBR322 en bacteriën met het recombinant pBR322.

20 Antibiotica

21 Kloneren in pUC18 en de selectie
pUC18 is een plasmide dat nog steeds veel wordt gebruikt. Selectie op het recombinant-DNA plasmide gaat veel sneller dan bij pBR322. Er wordt in de MCS gekloneerd (Multi Cloning Site). Hierdoor wordt het Lac Z gen onderbroken, waardoor witte kolonies ontstaan. Het originele pUC18 plasmide geeft blauwe kolonies. Het AmpR gen De ori De MCS (multi cloning site):

22 Selectie van transformanten
2 3 1 voedingsbodem met ampicilline en X-gal 1) niet-getransformeerde cellen gaan dood door het antibioticum (ampicilline) 2) getransformeerde cellen met een plasmide zonder het gekloneerde gen zijn blauw (zelfsluiters). 3) getransformeerde cellen met een plasmide met het insuline gen zijn wit

23 Het Lac Z gen is een onderdeel van het Lac operon
Een operon is een groepje genen dat door 1 promotor wordt aangestuurd. Het Lac operon regelt de afbraak van Lactose. Is er geen lactose, dan komen de genen niet tot expressie. Is er wel lactose, dan bindt de repressor liever aan lactose dan aan de operator en komen de genen tot expressie. Operon komt alleen bij prokaryoten voor.

24 Selectie op recombinant plasmiden m.b.v. het Lac Z gen
IPTG speelt dezelfde rol als Lactose Xgal is het substraat voor het product van het Lac Z gen = β-Galactosidase. In de agarplaat zit daarom voor de selectie: -ampicilline + Xgal + IPTG Welke kolonies zijn nu de recombinant pUC 18 plasmiden?

25 Het goede fragment is gekloneerd, maar het zit in de verkeerde oriëntatie.

26 Kloneren in een plasmide
Voor kloneren (recombinant DNA of genetic engineering) is nodig: Vector Restrictie enzym (en) Ligase DNA (om te kloneren) Gastheercellen Methode om DNA in gastheercel te krijgen Selectiemarker

27 Van welke kanten kan een bacterie in de natuur DNA verwachten???
In de natuur wordt een bacterie van verschillende kanten belaagd door DNA. Hiernaast zijn 3 manieren te zien. In het lab worden deze manieren nagebootst.

28 Er zijn nog verschillende andere methoden om DNA in een bacterie of eukaryote cel te brengen.
“Transformatie” kan op verschillende manieren plaatsvinden: door electroporatie via de CaCl2 methode door transfectie (hierbij wordt gebruik gemaakt van een virus) via de gun methode Transformatie-efficiëntie

29 Transformatie van bacteriën; de CaCl2 methode
calciumchloride maakt de celmembraan permeabel  de cellen worden nu competent genoemd. In dit stadium kunnen ze ingevroren worden bewaard. tijdens de heat shock gaat het DNA de cel in. 29

30 Transformatie van bacteriën via electroporatie
een andere manier is electroporatie tijdens de electroshock wordt de celmembraan permeabel en kan/gaat het DNA de cel in 30

31 Apparatuur voor de electroporatie

32 Kloneren in een plasmide
Voor kloneren (recombinant DNA of genetic engineering) is nodig: Vector Restrictie enzym (en) Ligase DNA (om te kloneren) Gastheercellen Methode om DNA in gastheercel te krijgen Selectiemarker Hoe weet je dat de digestie met het RE is gelukt?

33 Electroforese in een agarosegel.
(Ongeknipt) plasmide DNA kan bij electroforese in een agarose gel meerdere banden te zien geven. Het lineaire (geknipte) plasmide geeft (als de digestie compleet is verlopen) maar 1 band in de gel.

34 De verschillende stappen van agarosegel- electroforese.

35 Controle van de digestie m.b.v. agarose gel electroforese
Na het knippen (=digesteren) van het DNA ontstaan lineaire DNA fragmenten. De fragmenten kunnen m.b.v. agarosegel op grootte gescheiden worden Als referentie worden DNA fragmenten met een bekende lengte meegenomen, bv. de 1 kb ladder. Ijklijn

36 DNA ijklijn

37 Hoe wordt het DNA zichtbaar in de agarosegel???
Wanneer ethidium bromide aan een DNA-oplossing wordt toegevoegd “kruipt” het tussen de baseparen. Dit wordt intercalatie genoemd. Wanneer op een EtBR-DNA complex UV straling valt licht het DNA op (fluorescentie) Voorkom dat Ethidium bromide in je eigen DNA terecht komt. Het kan mutaties veroorzaken.

38 Het agarose % bepaalt het scheidend vermogen van de gel
Wanneer dezelfde DNA ladder in verschillende % agarose wordt ge-electroforeerd ziet het resultaat eruit zoals hiernaast afgebeeld. Afhankelijk van het agarose % is er een lineair verband tussen de loopafstand van het DNA fragment en de lengte in bp. Enkele voorbeelden staan hieronder.

39 Hoe weet je nu dat je de electroforese kunt beeindigen?
Bij deze electroforese zijn de kleurstoffen BFB en XC gebruikt als kleurmarkers. Je wilt zo kort mogelijk electroforeren, maar ook een zo groot mogelijke scheiding. DNA in oplossing is kleurloos. Door aan het DNA monster een opbrengbuffer met een kleurstof toe te voegen kan je het electroforeseproces volgen.

40 De functies van de opbrengbuffer (loading buffer).
De loading buffer heeft 3 functies: 1: Het bevat éen of meerdere kleurstoffen zodat het DNA monster zichtbaar wordt. 2: Het bevat een zwaarmaker zodat het DNA monster in het welletje zakt 3: De kleurstoffen bewegen dezelfde kant op als het DNA. De voortgang van de electroforese is zodoende zichtbaar. Er zijn 3 kleurstoffen die veel worden gebruikt; Orange G migreert alsof het 10 – 20 bp lang is Broomfenol blauw migreert ongeveer alsof het een DNA fragment is van 300 bp Xylene cyanol migreert alsof het 4000 bp is

41 Digestie van genomisch DNA
Ongeknipt Geknipt met BamHI Nucleic Acids Research Volume25, Issue22 Pp

42 Restrictiekaart: