Replicatie van de telomeren

Presentatie over: "Replicatie van de telomeren"— Transcript van de presentatie:

1 Replicatie van de telomeren
BIO 42 Replicatie van de telomeren Sequencen RFLPs en SSRs

2 Telomeren Telomeren bevatten lange stukken met repetitief DNA telomeer

3 Telomeren

4 DNA polymerase in actie

5 Replicatie van de telomeren
Per replicatie van het DNA wordt er een stukje telomeer niet verdubbeld!!! De lengte van de telomeren varieert per persoon. Bij de conceptie is de gemiddelde lengte bp, bij de geboorte bp. 20 jaar : 8000 bp, 50 jaar Het verlies is 50 – 100 bp per jaar.

6 Replicatie van de telomeren
Tijdens de replicatie wordt de RNA primer verwijderd. Er blijft daardoor aan de 5’-uiteinden van het DNA een gap over, een enkelstrengs - stuk DNA. Dit stukje ss DNA kan in de meeste cellen nooit meer dubbelstrengs gemaakt worden!!!!!! Het gaat om de telomeren van de chromosomen die daardoor steeds korter worden.

7 Verlenging van de telomeren.
In bepaalde cellen (voortplantingscellen, stamcellen en is het enzym telomerase actief = een enzym dat de telomeer-uiteinden kan verlengen.

8 Verlenging van de telomeren.
Telomerase is een eiwit-RNA complex met een reverse transcriptase werking.

9 Verlenging van de telomeren.
Telomerase is een eiwit-RNA complex met een reverse transcriptase werking.

10 De volgorde van de nucleotide sequentie bepalen.
sequencen De volgorde van de nucleotide sequentie bepalen.

11 De meest gebruikte methode is de sequentiemethode van dhr. Sanger
Frederick Sanger Born: 13-Aug-1918Frederick Sanger Birthplace: Rendcombe, Gloucestershire, England Died: 19-Nov-2013 2 x de Nobelprijs 1958 en in 1980

12 De Sanger sequence methode is een methode waarbij een nieuwe DNA-streng wordt gemaakt.
Bij die synthese worden naast de gewone dNTPs ook speciale nucleotiden gebruikt, de zg. dideoxynucleotiden Het principe van de sequentiemethode is de synthese van een nieuwe DNA streng op ss DNA…..dus DNA synthese in vitro. De synthese wordt op willekeurige plaatsen beëindigd door deze speciale dideoxynucleotiden.

13 De binding van de nieuwe nucleotide in de gewone replicatie
Nieuwe covalente band (fosfo- di-ester binding) dNTP dNMP

14 De ddNTP vergeleken met de dNTP
Voor de synthese van DNA is nodig: -een matrijs -een stukje ds DNA -een vrij 3’-OH uiteinde aan de laatste nucleotide Na inbouw van een dideoxynucleotide kan de synthese dus niet verder!!!

15 Replicatie met dNTPs en ddNTPs
De synthese van de nieuwe DNA streng met dNTPs en ddGTP geeft bv. bovenstaand resultaat Dezelfde reactie wordt in aparte epjes uitgevoerd op hetzelfde DNA met ddATP, ddCTP en ddTTP

16

17

18

19

20 DNA sequencing Tijdens de synthese wordt een label ingebouwd
zodat het nieuw gesynthetiseerde DNA te onderscheiden is van het originele DNA en te zien is!!! Het label kan aan de primer zijn gebonden of Aan een nucleotide; bv. aan dCTP dCTP, [α-32P]-

21 Voorafgaand aan de electroforese wordt het DNA gedenatureerd en ook de acrylamide gel bevat een denaturerend stofje. Waarom????????

22 Sequencen met fluorescerende labels
Elke ddNTP heeft zijn eigen fluorescerende label. De synthese van het nieuwe DNA kan daardoor in 1 epje plaatsvinden De electroforese kan daardoor ook in 1 epje plaatsvinden Een voorbeeld van een sequentiegel ziet er dan als volgt uit.

23 Sequencen met fluorescerende labels kan automatisch

24 RFLP RFLP = het verschil in lengte van DNA fragmenten wat
ontstaat na knippen met een RE RFLP = Restrictie Fragment Lengte Polymorfisme RE-knipsites puntmutatie duplicatie na knippen gelelectroforese RFLP’s ontstaan door een: - puntmutatie - insertie - deletie - duplicatie

25 RFLPs kunnen we gebruiken om ziektes aan te tonen.
Ziektes die je op deze manier aantoont zijn monogene ziektes; veroorzaakt door 1 gen. Ziektes als diabetes, reuma, psychiatrische aandoeningen zijn voorbeelden van polygene ziektes.

26 Sikkelcelanemie is ook aan te tonen met RFLPs
bij sikkelcelanemie ligt de puntmutatie in een herkennings- plaats (site) voor het restrictie enzym MstII ! 5’ – CCTNAGG – 3’ kb = kilobaseparen = 1000 baseparen

27 3% = Simple sequence repeats
SSRs zijn 1 – 3 nt die duizenden keren worden herhaald (Er zijn nog veel andere vormen van repeterend DNA) In deze repeterende gebieden kan het gebeuren dat het DNA polymerase “slipt”. Hierdoor komt het vrij vaak voor dat het aantal “repeats” per persoon verschilt!!!! Dit noemt men polymorfisme…… of VNTR = Variabel Number of Tandem Repeats

28 VNTRs zijn erfelijk Een kind heeft altijd een combinatie van VNTRs van de moeder en van de vader. P = parent F = filus = kind = volgende generatie

29 De erfelijkheid van VNTRs in beeld gebracht
Bij ieder kind is het VNTR -patroon een combinatie van bandjes van de beide ouders. Een aantal kinderen hebben hetzelfde patroon Wat moet je doen om alle kinderen van elkaar te onderscheiden??? man “getrouwd” vrouw Kinderen, eerste kind staat links

30 Repetitief DNA Repetitief DNA kan gebruikt worden om de afkomst van DNA te achterhalen (bv. bij een moordzaak) Er wordt een PCR uitgevoerd waarbij meerdere repetitieve stukken DNA worden vermeerderd.

31 Hoe kom je aan materiaal om een dergelijke proef te doen???
DNA Evidence Is Left Behind In A Variety Of Forms A skin cell, blood, and the shaft of a hair (shown from left to right) all contain DNA and can be collected as crime scene evidence. (Microscopic images of the skin cell and hair shaft courtesy of Joseph A. Brzostowski)

32 Een overzicht van het experiment
Omdat het om zeer kleine hoeveelheden kan gaan wordt vaak nog gebruik gemaakt van een vermenigvuldigings stap: De PCR reactie.

33 Een voorbeeld van het gebruik van een DNA fingerprint om vast te stellen wie de dader is.
I.p.v. PCR kunnen de VNTRs aangetoond worden door met restrictie enzymen te knippen. Er ontstaan dan RFLPs.

34 Persoonlijke DNA profielen

35 Injustice Corrected It takes both sequences at all 13 sites to prove a DNA match,
………. but it only takes one sequence to prove a mismatch. DNA evidence has been used to liberate a growing number of people who were falsely imprisoned for crimes they did not commit.